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甘草酸是甘草的主要有效成分,具有抗炎、调节免疫和抗病毒等活性,临床上已被开发成重要的治疗乙肝药物。同样,甘草酸也是重要的甜味剂,其甜度是蔗糖的150倍。目前,甘草酸生物合成途径中大多关键酶已经被成功表征,包括关键的β-香树脂醇合成酶(bAS)和两个重要的细胞色素P450酶(CYP88D6和CYP72A154),但是催化最后两步关键反应的糖基转移酶(UGT)仍然没有被表征。本研究基于深度转录组多重数据分析和多证据链表征的方法成功获得了甘草酸生物合成相关的关键UGT。具体内容如下:(1)UGT是一个庞大的超家族酶系,为获得甘草酸生物合成相关的候选UGT,本研究采用高通量转录组测序结合多重数据分析的方法筛选目标UGT。测序结果显示,本研究获得的样品的Clean bases均达到10G以上,测序深度深;样品测序数据错误率为0.02%,Q20>96%,Q30>90%,测序数据的正确率高,质量优;Unigenes的总量有112307个,最短长度为201 bp,最长长度为16990 bp,平均长度为703 bp,中间长度为378 bp,N50为1164,N90为272。GO分类统计显示,有大量的unigenes参与代谢过程,具有催化活性;KOG分类统计显示,参与生理活动的unigenes较多,特别是在转录、翻译、信号转导水平;KEGG通路分析显示,有415个unigenes参与次生代谢生物合成,有295个unigenes参与萜类或聚酮类代谢。该结果暗示unigenes包含了大量与研究相关的基因,为甘草酸代谢途径的解析提供了坚实的基础。将unigenes在七大数据库(包括 Nr,Nt,Pfam,KOG/COG,Swiss-prot,KEGG,GO)中进行功能注释显示,获得的unigenes共包含潜在的434个UGT基因,进一步通过差异表达分析和共表达分析等,最终筛选得到了 8个候选UGT,分别依次命名为UGT1至UGT8,用于下一步研究。(2)为获得8个候选UGT的基因信息,本研究克隆了 8个候选糖基转移酶基因并进行了生物信息学分析。结果显示,克隆的UGT1基因的cDNA全长为1524 bp,编码507个氨基酸残基,理论分子量(MW)为56.83kDa,等电点(PI)为5.58。克隆的UGT2基因的cDNA全长为1110 bp,编码370个氨基酸残基,MW为42.53kDa,PI为5.99。克隆的UGT3基因的cDNA全长为1446 bp,编码481个氨基酸残基,MW为53.85kDa,PI为5.88。克隆的UGT4基因的cDNA全长为1443 bp,编码480个氨基酸残基,MW为53.15kDa,PI为6.23。克隆的UGT5基因的cDNA全长为1422 bp,编码473个氨基酸残基,MW为53.16kDa,PI为6.94。克隆的UGT6基因的cDNA全长为1338 bp,编码445个氨基酸残基MW为49.36kDa,PI为6.29。克隆的UGT7基因的cDNA全长为1473 bp,编码490个氨基酸残基,MW为55.24kDa,PI为5.89。克隆的UGT8基因的cDNA全长为1473 bp,编码499个氨基酸残基,MW为56.12kDa,PI为6.06。所获得的8个候选UGT的亲水性均较强,蛋白结构稳定,可能并非分泌蛋白,基本处于膜外,二级结构均主要含有αα螺旋,延伸链,β折叠,无规则卷曲。结构分析表明可能均属于UGT超家族。(3)为表征获得的8个候选UGT的活性,本研究将8个候选UGT与pET32a(+)重组构建表达载体,在BL21(DE3)菌株中诱导表达,获得的粗酶用于体外催化反应。结果显示,UGT1、UGT2、UGT4、UGT5、UGT6、UGT7、UGT8 的催化产物中均没有检测到甘草酸,但惊喜的发现是,UGT3(命名为GuUGAT)能完成连续的两步苷化反应,直接催化甘草次酸产生甘草酸。为进一步确认GuUGAT的催化活性,本研究继续将GuUGAT蛋白进行纯化后再次催化分析。结果同样证实,GuUGAT具有催化甘草次酸经过连续两步苷化反应直接产生甘草酸的活性。该结果证实,我们已成功获得了具有目标活性的UGT。(4)为进一步研究新发现的GuUGAT的生化及表达特征,本研究继续对该酶的催化参数、表达方式、系统发育等进行了研究。反应动力学参数分析结果显示,GuUGAT以甘草次酸为底物的Kcatand Km分别为2.85 s-1和36.2μM,以甘草次酸单葡萄糖醛酸为底物的Kcat and Km是0.12s-1和4.3μM。基因表达分析结果显示,GuUGAT在根茎叶中均有微量表达,但在根中经盐和干旱刺激后其表达量会显著提高,相应地,甘草酸的含量也显著增加。共表达网络分析证实GuUGAT与甘草酸生物合成的关键基因SQE、SQS、bAS和CYP88D6等存在共表达关系。GuUGAT和bAS表达量分析同样显示GuUGAT和bAS表达量的变化趋势有明显的一致性。这些证据共同一致地证明GuUGAT参与了甘草酸的生物合成。系统发育分析表明,GuUGAT可能属于UGT73家族。但是值得注意的是,GuUGAT,与其他三萜UGT不一样,GuUGAT独立成支。该结果暗示GuUGAT可能为UGT家族亚支中新的代表成员。上述证据共同证实本研究发现的GuUGAT是能催化连续两步苷化反应直接使甘草次酸转化为甘草酸的一个新颖的UGT。(5)为进一步研究GuGAT潜在的催化机制,本研究通过同源序列比对分析和分子对接的方法选择了9个位点进行点突变的研究,结果显示,Q352A,H22A,W370A,E375A和Q392A能使GuUGAT的催化活性下降约60-70%,可能是GuUGAT的关键活性位点。综上所述,本研究成功获得了具有目标活性的GuUGAT,并且惊喜地发现该酶是植物重要天然产物相关UGT中首个能催化两步葡萄糖醛酸化的UGT,同时也是三萜UGT中首个能将UDP-GlcA作为糖基供体的UGT,属于全新的发现。GuUGAT的发现为甘草酸的生物全合成及甘草的遗传育种奠定了坚实的基础。