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薏苡（Coix Lachrymajobi L.）为禾本科薏苡属的一年或多年生草本植物,其成熟种仁称为“薏米”,被誉为“世界禾本科植物之王”和药食同源的“粮药”之一。贵州,已发展成为薏米种植和加工的全球集聚地。近年来,微生物发酵转化植物基质提升产品品质和生理功能,已成为杂粮杂豆研究的热点领域。课题组前期研究发现Bacillus subtilis BJ3-2发酵精薏米可高量富集川芎嗪和纤溶酶。因此,为了揭示川芎嗪形成的基质及菌株依赖性,本论文借鉴日本纳豆发酵思路,以糙薏米、精薏米和碎薏米为原料,以两株芽孢杆菌B.subtilis BJ3-2和CICC 20637为菌株,构建高产川芎嗪的薏米发酵体系,跟踪主要营养功能成分量变动态,对发酵过程中川芎嗪合成的关键酶及前体物进行关联剖析,并采用转录组学和蛋白组学技术剖析其高产川芎嗪机理,同时探讨B.subtilis BJ3-2发酵薏米不同提取组分的体外抗肿瘤活性。主要结论如下:1.B.subtilis BJ3-2发酵薏米高产川芎嗪及其干制优化体系构建以川芎嗪和纤溶酶为指标,通过单因素及Box-Behnken试验优化,结果表明,接种量为9.0%、发酵温度为40℃和发酵时间为93 h时,B.subtilis BJ3-2发酵糙薏米中川芎嗪产量和溶纤酶酶活最高（分别达6.15 mg/g DW和2236.47 U/g）。以真空冷冻干燥样品为基准,五种干燥方式中真空微波干燥样品的川芎嗪相对保留率最高（达64.5-75.51%）,可作为一种高效、低成本干燥方式。2.B.subtilis BJ3-2发酵糙薏米富集川芎嗪与关键酶及前体物的量变关联B.subtilis BJ3-2发酵糙薏米（BDA组）和发酵黄豆（BSB组）以及CICC 20637发酵糙薏米（CDA组）三个体系中川芎嗪形成与关键酶和前体物的关联性进行剖析,结果表明:BDA组和CDA组的发酵环境均呈酸性,而BSB组的环境呈碱性;α-乙酰乳酸合成酶和α-乙酰乳酸脱氢酶在BDA体系中高酶活持续时间较长。BDA组的还原糖、丙酮酸、双乙酰和乙偶姻含量较高,而BSB组的总游离氨基酸和铵含量较高。BDA体系中川芎嗪含量在发酵过程中均比BSB和CDA体系高;且发酵结束时,BDA组中川芎嗪含量是BSB组和CDA组的204倍和12倍。BDA组和CDA组中川芎嗪形成与丙酮酸、双乙酰、铵和乙偶姻显著相关（r>0.84,p<0.05）。3.高产川芎嗪发酵糙薏米体系B.subtilis BJ3-2菌体转录组学剖析对BDA、BSB和CDA三组发酵过程中关键时间节点的菌体进行RNA-seq和q RT-PCR测序与验证,结果显示:在BDA4-vs-BSB4、BDA24-vs-BSB16和BDA32-vs-BSB24中分别有496、827和1247个差异表达基因;BDA4-vs-CDA4、BDA24-vs-CDA24和BDA32-vs-CAI32中分别筛选出了1323、1715和1251个差异表达基因。与BSB组和CDA组相比,BDA组的淀粉与蔗糖代谢、磷酸肌醇代谢、三羧酸循环和糖酵解/糖异生路径显著富集（p<0.05）,其为细胞活动提供能量、合成大量有机酸及足够的中间体丙酮酸。同时,BDA组的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢,2-氧代羧酸代谢和氨基酸生物合成路径显著增强（p<0.05）,可合成高含量的中间体α-乙酰乳酸。进一步地,BDA组的C5-支链二元酸代谢或丁酸甲酯代谢中关键基因als S和als D表达上调,为川芎嗪合成提供足量的前体乙偶姻。BDA组的精氨酸生物合成路径显著富集（p<0.05）,氮素代谢路径倍抑制可为体系提供适中的前体氨。此外,BDA组的的鞭毛组装和细菌趋化性途径显著增强（p<0.05）,可提高细胞的抗逆性。als S和als D等21个差异表达基因的q RT-PCR验证结果与RNA-seq结果相符,说明RNA-seq的数据准确可靠。4.基于蛋白组学的B.subtilis BJ3-2发酵糙薏米高产川芎嗪调控路径探讨对BDA、BSB和CDA三组发酵过程中关键时间节点的菌体进行蛋白组测序和差异表达蛋白鉴定,结果表明:BDA24-vs-BSB16和BDA24-vs-CDA24中分别有304和297个蛋白表达显著差异（p<0.05）。与BSB16和CDA24相比,BDA24的氨基酸生物合成,2-氧代羧酸代谢,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成通路显著富集（p<0.05）,其乙酰羟酸合酶（大亚基,NP＿390709.;小亚基,NP＿390708.2）表达上调,致使中间体α-乙酰乳酸大量积累。C5-支路二元酸代谢途径显著增强（p<0.05）,其中乙酰羟酸合酶（NP＿390709.1和NP＿390708.2）和α-乙酰乳酸合成酶（NP＿391482.2）均可将丙酮酸合成α-乙酰乳酸,随后α-乙酰乳酸脱羧酶（NP＿391481.1）将α-乙酰乳酸转化成前体物乙偶姻。同时,BDA24的三羧酸循环、糖酵解途径、碳代谢及不同环境下的微生物代谢通路显著被抑制（p<0.05）,其乙偶姻脱氢酶复合系统（NP＿88687.1、NP＿388688.1、NP＿388689.1和NP＿388690.1）表达下调,乙偶姻降解能力降低。BDA24的精氨酸生物合成通路的抑制使环境中氨含量适中,其促进川芎嗪的高效合成。此外,BDA24中群体效应显著富集（p<0.05）,B.subtilis BJ3-2菌体间在糙薏米基质中协调能力强,更好地生长繁殖及代谢。α-乙酰乳酸合成酶（NP＿391482.2）和α-乙酰乳酸脱羧酶（NP＿391481.1）等10差异表达蛋白的PRM定量分析结果与TMT标记的定量结果相符,表明TMT标记的定量蛋白组学结果准确可靠。5.B.subtilis BJ3-2发酵糙薏米功效组分剖析及体外抗肿瘤活性评价对B.subtilis BJ3-2发酵糙薏米不同极性组分的体外抗肿瘤活性加以评价,结果表明:正丁醇组分能够明显地抑制人白血病K562和人肺腺癌A549细胞的增殖,IC50分别为134.55μg/m L和176.11μg/m L,对人胚胎肾239T正常细胞无抑制作用;其活性成分主要含有川芎嗪（4.62 mg/g DW）、γ-氨基丁酸（13.90 mg/g DW）和酚类化合物（共9个）。正丁醇组分处理后,K562和A549细胞出现细胞核固缩及碎裂、细胞膜轮廓不清晰、可见浓缩致密的颗粒块状强荧光,且随着浓度增加,细胞凋亡更加明显;PI染色法显示K562和A549细胞的G1阶段细胞含量均增加,G2阶段细胞含量减少;Annexin V-FITC/PI双染法表明可使K562和A549细胞凋亡率增加;Western blot检测发现K562和A549细胞中凋亡蛋白Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9和Bax表达显著升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著下降,并呈剂量关系。综上所述,以接种量9%、发酵温度40℃和发酵时间93 h为发酵条件,B.subtilis BJ3-2发酵糙薏米可获得高产量的川芎嗪。乙偶姻的高合成与低降解、适中的铵/氨含量、B.subtilis BJ3-2菌体协调、弱酸性发酵环境是B.subtilis BJ3-2发酵糙薏米高产川芎嗪关键成因,确证了川芎嗪代谢调控路径,即:氨基酸生物合成、C5-支路二元酸代谢、丁酸甲酯代谢途径和碳代谢等相关通路影响乙偶姻的积累及发酵环境的变化,精氨酸生物合成通路的抑制调节氨含量,群体效应增强B.subtilis BJ3-2菌体繁殖代谢能力。B.subtilis BJ3-2发酵糙薏米正丁醇组分对人白血病K562细胞和人肺腺癌A549细胞具有较强的抗肿瘤效应,其活性成分主要为川芎嗪、γ-氨基丁酸和酚类化合物。