miRNA是新发现的一类内源性表达的单链短序列小RNA,长度约19-25个核苷酸序列,不编码蛋白质,广泛存在于真核细胞中,在进化上具有保守性。miRNAs通常与靶mRNA的3’非编码区(3’-untranslated region,3’-UTR)不完全互补配对结合,引起靶mRNA的降解,在转录后水平负调控靶基因的表达。大量研究表明miRNA可以对多种细胞生物学行为发挥重要的调控作用,包括个体的发育、细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等。研究发现miRNA与多种疾病的发生发展紧密相关,包括肿瘤。在肿瘤中,miRNA可能发挥肿瘤抑制因子的作用,也可能发挥癌基因的作用。已有大量研究提示miRNA在很多实体瘤及血液系统肿瘤中异常表达。为了进一步认识miRNA的分子机理,科学家们也将研究的内容进一步扩展到对miRNA下游靶点的研究。由于一个miRNA可能拥有大量的下游靶点,一个靶点也可能受多个上游miRNA的调控,在肿瘤miRNA表达谱研究的基础上精确阐明单个miRNA的作用及其分子机理是当务之急,也是肿瘤miRNA分子靶向治疗的研究关键。虽然目前miRNA与胃癌的相关性在逐渐受到关注,但这方面的研究仍滞后于miRNA与其他常见肿瘤的相关研究。中国是胃癌的高发国家,据世界权威专家估计,全世界每年新发生的胃癌为75.5万例,其中约35%发生在中国。我国胃癌发病率和死亡率在世界上都处于较高水平。虽然目前采取了包括手术、化疗以及其他综合性治疗措施,胃癌的治疗效果仍不是十分理想,五年生存率低下。而且我们对于胃癌的发病机理尚缺乏更全面和深入的了解,临床上也缺乏特异性的胃癌肿瘤标记物。因此,深入研究胃癌的发生发展机制,寻找新的生物标记物和治疗靶标,提高胃癌的早期诊断率和临床预后都迫在眉睫。本课题首先采用生物芯片技术初步筛选在胃癌组织与远端非肿瘤组织中表达具有显著性差异的miRNAs,通过实时定量PCR技术对其中改变最显著的miR-375进行临床样本验证。然后通过建立体外细胞模型和裸鼠体内肿瘤模型研究miR-375对胃癌细胞多种生物学行为的影响,并利用预测软件寻找miR-375的上游调控因子和下游靶基因,阐明其在胃癌中发挥作用的可能分子机理。本课题的研究成果将加深我们对胃癌发病的分子机理的了解,为胃癌的早期诊断和治疗提供新的线索,同时为相关的新药开发提供重要的分子靶点。1.研究材料和方法1.1细胞培养和临床样本的收集购买胃正常上皮来源细胞株GES-1和胃癌细胞株AGS、MGC-803、HGC-27、BGC-823和SGC-7901。在胃癌手术过程中收集胃癌组织及其配对的远端非肿瘤胃组织；在胃镜室收集胃癌粘膜组织和非肿瘤胃粘膜组织。标本收集后分为两份,一份迅速保存在液氮中备用,另一份进行病理检查。1.2胃癌中异常表达miRNAs筛选及目标miRNA的选择与验证采用生物芯片初步筛选在胃癌组织中表达明显改变的miRNAs。再采用实时定量PCR技术在临床胃癌标本和胃癌细胞中对其中改变最为明显的miR-375进行表达验证。分析利用miR-375表达水平来区分正常胃组织和胃癌组织的特异性和敏感性以及miR-375的表达水平与胃癌样本各临床参数之间的相关性。1.3 miR-375对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响通过转染miR-375的前体小分子增加胃癌细胞中miR-375的表达水平,综合应用各种分子细胞生物学和现代显微成像技术,观察胃癌细胞的增殖(细胞计数法、MTT法)、迁移(Transwell方法、细胞划痕实验)和侵袭(Matrigel侵袭实验)等生物学行为的变化。1.4建立裸鼠胃癌肿瘤模型研究miR-375对胃癌肿瘤生长的影响建立裸鼠皮下移植瘤模型。裸鼠腋下皮下注射胃癌细胞,待肉眼可见的瘤体长出时,隔天测量瘤体大小(最大和最小直径)。当瘤体最大直径到达20mm时颈椎脱臼处死裸鼠,剥离移植瘤组织,称量瘤体重量,绘制生长曲线。1.5 miR-375下游靶点的预测、验证及功能研究利用miRanda, TargetScan,和PicTar三个预测软件,综合分析相关因素,筛选出miR-375可能的下游靶点Jak2。利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-375对靶Jak2的负调控作用。在胃癌细胞中过表达miR-375后利用蛋白印迹实验检测靶Jak2蛋白水平的改变。另外检测胃癌手术样本中的Jak2蛋白水平,并对其和miR-375的表达水平作相关性分析。利用RNAi技术降低胃癌细胞中Jak2的蛋白表达水平,综合应用各种分子细胞生物学和现代显微成像技术,观察胃癌细胞的增殖(细胞计数法、MTT法)、迁移(Transwell方法、细胞划痕实验)和侵袭(Matrigel侵袭实验)等生物学行为的变化。再利用过表达Jak2的拯救实验观察被miR-375抑制的细胞表型能否被Jak2部分或完全逆转。1.6 miR-375上游调控因子的预测及验证寻找包含miR-375启动子的基因组序列,软件预测可能与之结合的上游转录因子,改变细胞内转录因子的表达水平后检测miR-375表达水平的改变。利用荧光素酶报告基因实验检测转录因子对miR-375启动子序列转录活性的影响。利用实时定量PCR的方法检测胃癌样本中转录因子mRNA的水平,并对其与miR-375的表达水平进行相关性分析。2.主要研究结果2.1 miR-375在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达水平显著下调。miR-375的表达水平区分胃癌组织和胃非肿瘤组织具有较高的特异性(82.4%)和敏感性(88.2%)。统计学结果显示miR-375的表达水平与各临床病理特征之间不存在显著相关性。2.2外源性过表达miR-375能显著抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及瘤体的生长。2.3 Jak2可能是miR-375的下游靶点,其在胃癌组织中表达增高,且过表达miR-375能显著降低Jak2的蛋白水平,二者在胃癌组织中的表达水平呈现负相关性。2.4降低Jak2表达水平后对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制效果与过表达miR-375相似,且在过表达miR-375的基础上再过量表达Jak2能部分或完全逆转miR-375对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。2.5 miR-375在胃癌中的表达可能受到上游转录因子Snail的负调控。3.结论3.1 miR-375在胃癌组织中的表达呈显著下调趋势,可能是因为受到在胃癌中表达上调的转录因子Snail的负调控,提示miR-375可能在胃癌的发生发展过程中起到抑癌基因的作用。3.2过量表达miR-375或降低Jak2的表达均能显著抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,miR-375过表达产生的抑制作用还能被其可能的下游靶点Jak2逆转,提示miR-375可能通过调控Jak2的表达来参与胃癌的发生发展过程。3.3用miR-375的表达水平来区分胃癌组织和非胃癌组织能达到超过80%的特异性和敏感性,另外,miR-375及其下游靶点Jak2在胃癌组织中的表达水平呈现负相关性。提示二者均有成为胃癌诊断或治疗新靶点的潜在可能性。