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目的:肿瘤细胞表面高表达的PD-L1分子,是一种起负调控作用的免疫抑制分子,通过与T淋巴细胞表面的PD-1分子相互作用,导致T细胞免疫应答功能受到抑制,并使CD8+T淋巴细胞的抗肿瘤功能减弱。在本研究中,我们应用FA-GNRsiPD-L1沉默肿瘤细胞PD-L1的表达,进而阻断PD-L1与PD-1之间的相互作用,恢复CD8+T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,从而提高免疫应答能力。通过联合FA-GNR的光热作用,探讨靶向肿瘤的PD-L1基因沉默免疫治疗协同光热治疗对B16-BL6黑色素瘤小鼠的治疗效果。方法:1.琼脂糖凝胶阻滞实验检测FA-GNR对siRNA的负载能力。2.MTT法检测FA-GNR的细胞毒性。3.流式细胞术及荧光倒置显微镜观察负载Cy3-siGAPDH的FA-GNR对黑色素瘤细胞B16-BL6的转染效率。4.q-PCR及流式细胞术检测FA-GNR-siPD-L1对B16-BL6细胞PD-L1基因/蛋白的沉默效果。5.siPD-L1沉默后的B16-BL6黑色素瘤细胞与B16-BL6黑色素瘤荷瘤C57BL/6小鼠的T细胞混合培养,q-PCR检测T细胞上免疫抑制分子PD-1、TIM-3、BTLA的表达及细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ的表达,Annexin V/PI染色法检测混合培养后T细胞的凋亡情况。6.构建C57BL/6小鼠黑色素瘤荷瘤模型,尾静脉注射FA-GNR-siPDL1进行免疫治疗的同时协同光热治疗,观察联合治疗对小鼠肿瘤的治疗效果。7.收集来自各实验组脾脏的T淋巴细胞,流式检测T细胞耗竭表型变化,q-PCR检测T细胞IL-2、TNF-α、IFN-γ的表达情况。8.经磁珠分选法分离出各组脾脏中的CD8+T细胞,通过LDH试剂盒测定其对肿瘤细胞的杀伤作用,CCK8检测T细胞的增殖能力。结果:1.琼脂糖凝胶阻滞实验结果表明FA-GNR最大程度负载siRNA的比例为3.5:1。2.MTT法结果表明修饰叶酸后的金纳米棒材料FA-GNR毒性下降。3.荧光显微镜观察结果显示FA-GNR在叶酸作用下能够有效地将siRNA转染细胞。流式结果表明随着材料浓度的增加,对Cy3-siGAPDH的转染效率随之增加,FA-GNR的浓度在20μg/ml左右,其转染效率趋于稳定,因此我们将FA-GNR的最适转染浓度确定为20μg/ml。4.q-PCR检测结果显示FA-GNR-siPD-L1体外转染B16-BL6细胞24 h后,PDL1基因的沉默效率达80%,同时流式结果显示蛋白沉默效率为68%,两者均有显著的PD-L1表达降低,表明FA-GNR可以有效地沉默B16-BL6细胞中的PD-L1基因。5.FA-GNR-siPD-L1基因沉默后的肿瘤细胞与B16-BL6荷瘤小鼠的T淋巴细胞混合培养后,可阻断诱导T细胞耗竭,表现为T细胞表面抑制性受体PD-1、TIM-3、BTLA的表达下调,T细胞的凋亡减少。6.尾静脉注射FA-GNR-siPDL1并联合光热效应对B16-BL6黑色素瘤荷瘤小鼠进行治疗,结果显示PD-L1基因沉默和金纳米棒的光热作用两者协同治疗可显著抑制黑色素瘤的生长速度,增强小鼠的抗肿瘤能力。7.本研究构建的FA-GNR-siPDL1治疗方法,可以调控耗竭性T细胞表面抑制性受体PD-1、TIM-3、BTLA的表达,及促进免疫相关细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ的分泌。8.治疗组小鼠CD8+T细胞具有更强的细胞毒性T细胞的杀伤作用,并且激活T淋巴细胞的增殖。结论:1.本研究构建的FA-GNR-siPD-L1转染体系,能高效地转染siPD-L1至黑色素瘤细胞,并有效地沉默其PD-L1的表达。2.应用FA-GNR-siPDL1并联合金纳米棒的光热作用能够有效抑制小鼠黑色素瘤的生长,逆转T细胞耗竭,重新激活T细胞的抗肿瘤免疫应答能力。