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研究背景：
胰腺癌是恶性肿瘤胰腺中最常见的一种，其引起的死亡在肿瘤相关性死亡中排第四位。近年来，胰腺癌的发病率在全世界范围内均有增加趋势。因为胰腺癌的临床表现和症状通常不明显，早期诊断胰腺癌十分困难。通过基础研究及临床工作者的多方面努力，胰腺癌的诊治水平有了很大提高，但是临床上胰腺癌仍呈现早期诊断率低，根治性手术切除率低、易转移及复发，五年生存率低的状况.胰腺癌是预后最差的癌肿之一。阐明胰腺癌的发生发展的分子机制对提高其诊治水平有及其重要的意义。长期以来，对胰腺癌的分子机制研究多集中于蛋白编码基因。近来研究发现microRNA(miRNA)是一类真核生物内源性小分子单链非编码RNA,长度通常为18～25个核苷酸，miRNA通过参与转录后调控控制基因表达及细胞分化、增殖和凋亡等多种功能，可能对基因功能研究、人类疾病防治及生物进化探索有重要意义。
随着miRNA家族及其多种调控功能的发现，业已证明它们参与细胞增值和分化、细胞凋亡等一系列生命过程。并与多种肿瘤的发生发展密切相关。如何发现与肿瘤相关的miRNA，阐明其作用及调控机制，是目前医学研究的热点和前沿。
人工合成的miRNA已经成功用于沉默预期靶基因的表达及其功能研究，反义miRNA(miRNA inhibitor)是化学合成的专门针对细胞中某特异的靶miRNA的抑制剂，特异的靶向敲除单个的miRNA分子。
miRNA与胰腺癌的发生发展、临床诊治和预后的关系及调控机制远没有被阐明，因此有必要发掘与人类胰腺癌相关的miRNA，对其作用机制深入了解。从不同于蛋白编码基因的角度在分子水平阐明胰腺癌的本质，不仅可能为胰腺癌的早期诊断、治疗疗效的评估提供重要的分子依据，为胰腺癌的治疗提供新的靶点。
我们前期用博奥公司和康成公司的芯片分别检测了胰腺癌组织和胰腺癌细胞中的miRNA表达谱，且文献报导胰腺癌组织和多个胰腺癌细胞系miR-196a表达异常增高，有研究提示miR-196a与胰腺癌的预后相关。
目的：
1.探讨miR-196a在胰腺癌中的表达情况
2.反义miR-196a对胰腺癌生物学活性的影响。
材料和方法：
实验材料：
细胞系
人胰腺癌细胞系PANC-1、SWl990、BXPC-3、CAPAN-2、永生化的正常胰腺导管上皮细胞，由中山大学附属第二医院消化内科实验室提供。胰腺癌细胞培养在DMEM高糖培养基中。永生化的正常胰腺导管上皮细胞培养在K-SFM。
实验方法：
用Real Time PCR方法检测miR-196a在胰腺癌细胞系和永生化的正常胰腺导管上皮细胞中的表达。使用化学合成的反义miR-196a，使用Lipofectamine2000作为转染试剂转染胰腺癌细胞系。Real Time PCR方法检测转染miR-196a inhibitor的胰腺癌细胞的抑制效率。用WST法检测转染后胰腺癌细胞的体外细胞活力。流式细胞技术(FCM)检测转染后胰腺癌细胞细胞周期。采用流式细胞技术法检测转染后胰腺癌细胞的细胞凋亡情况。利用Transwell小室法检测转染后的胰腺癌细胞迁移能力；
统计方法
数据以均数±标准差表示，多组均数间比较采用单因素方差分析。应用SPSS13.0 for windows统计软件进行统计学处理。显著性差异水平为P＜0.05。
结果：
1. miR-196a在人胰腺癌细胞系表达比永生化的正常胰腺导管上皮细胞H6C7高，PANC-1、SW1990、BXPC-3、CAPAN-2分别为H6C7的707.5倍、317.4倍、6.276倍、209.9倍，其中以PANC-1表达最高。
2.人工化学合成的miR-196a inhibitor(miR-196a IN)能以Lipofectamine2000为载体转染入PANC-1并能下调该细胞的miR-196a的表达。
3.WST-8法检测PANC-1转染后细胞活力。转染miR-196a inhibitor后PANC-124h细胞活力检测示空白组vs.lipo组vs.miR-NC组vs.miR-196a IN组分别OD值为(0.173±0.050)vs.(0.132±0.186)vs.(0.140±0.048)vs.(0.140±0.490)；48h OD值为(0.310±0.139)vs.(0.112±0.031)vs.(0.127±0.010)vs.(0.108±0.013)；72h OD值为(1.644±0.122)vs.(1.347±0.135)vs.(1.395±0.124)vs.(1.258±0.142)；三个时间点四组数据差异无统计学意义，(P＞0.05)。
4.流式检测转染miR-196a inhibitor后PANC-1细胞各组细胞早期凋亡情况没有差异(P＞0.05)。空白组vs.lipo组vs.miR-NC组vs.miR-196a IN组细胞早期凋亡情况分别24h：(13.37±3.98)vs.(13.92±4.17)vs.(13.56±7.55)vs.(11.76±8.16)；48h；(9.79±4.40)vs.(14.47±6.47)vs.(15.57±5.45)vs.(15.46±7.99)；72h：(12.68±5.2)vs.(11.39±0.72)vs.(12.54±5.73)vs.(13.71±6.40)。
5.流式检测转染miR-196a inhibitor后PANC-1细胞周期以静止期细胞为主，但是24h、48h、72h各组细胞之间的细胞周期分布没有差异(P＞0.05)。其中处于G0/G1期：空白组vs.lipo组vs.miR-NC组vs.miR-196a IN组分别为24h：(49.44±5.32)vs.(58.01±6.48)vs.(63.72±6.97)vs.(62.51±6.87)；48h：(48.10±5.76)vs.(58.68±3.99)vs.(61.01±4.87)vs.(59.90±4.46)；72h：(47.67±1.40)vs.(54.22±4.43)vs.(53.18±2.49)vs.(56.37±-2.24)。处于G2/M/S期：空白组vs.lipo组vs.miR-NC组vs.miR-196a IN组分别为24h：(50.56±5.33)vs.(41.98±6.48)vs.(36.24±7.00)vs.(37.48±6.87)；48h：(51.9±5.76)vs.(41.31±3.99)vs.(38.99±4.87)vs.(40.09±4.46)；72h：(52.33±1.40)vs.(45.78±4.43)vs.(46.82±2.49)vs.(43.63±2.24)。
6.Transwell小室模型检测转染miR-196a inhibitor后PANC-1的细胞细胞体外迁移能力下调，差值具有统计学意义(P＜0.05)。在200×视野中PANC-1细胞平均穿膜细胞数为：空白组vs.1ipo组vs.miR-NC组vs.miR-196a IN组在48h为：(71.00±5.07)vs.(56.00±7.07)vs.(58.20±5.59)vs.(42.38±4.96)；在72h为(100.40±5.09)vs.(87.30±10.15)vs.(92.18±6.73)vs.(66.56±12.72)。
结论：
1.miR-196a在人胰腺癌细胞系PANC-1、SW1990、CAPAN-2、BXPC-3呈高表达。
2.转染反义miR-196a对PANC-1体外细胞活力、细胞凋亡和细胞周期没有影响，但可降低其细胞体外迁移能力。