论文部分内容阅读
目的: 1.对维持性血透患者自体动静脉内瘘(AVF)失功的发生率及其影响因素进行回顾性分析，并探讨糖尿病肾病与非糖尿病肾病患者在AVF使用时间、AVF失功发生率等方面的差异; 2.留取AVF失功行重建术患者的内瘘狭窄部位组织进行免疫组化及分子生物学分析，探讨血管内膜增生的发生机制及糖尿病、高血压对AVF内膜增生的影响; 3.体外培养大鼠腹主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)，观察丹参酮ⅡA(TanⅡA)对其增殖与迁移的影响及可能作用机制。 方法: 1.临床观察:以我院血透中心73例首次发生自体AVF失功的患者为内瘘失功组，选取同期自体AVF功能良好的136例维持性血液透析患者为内瘘通畅组，比较两组患者各项临床及生化指标，分别进行单因素分析及logistic回归分析。 2.血管组织标本:收集维持性血透患者行AVF成形术及重建术时的头静脉血管组织，将其按原发病的不同分为慢性肾小球肾炎组、高血压肾损害组及糖尿病肾病组，HE染色观察血管组织形态学变化，并测量各组血管组织的内膜、中膜厚度;免疫组织化学法检测血管平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的表达。选取对照组(AVF0月时的血管组织)和内瘘使用寿命在12-18月的血管组织，免疫组化检测碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素生长因子1（IGF-1）、血管内皮生长因子(VEGF)、金属基质蛋白酶2(MMP2)及金属基质蛋白酶9(MMP9)的表达变化，并分析a-SMA表达与各生长因子之间的相关性。 3.体外细胞实验:采用CCK8法筛选VSMC增殖的最适胎牛血清(FBS)浓度，然后将VSMC分为3组:(1)对照组:VSMC加入5％FBS培养液;(2)增殖组:VSMC加入30％FBS培养液;(3) TanⅡ A干预组:①10mg/l TanⅡ A+30％FBS;②20mg/l TanⅡA+30％FBS;③40mg/lTanⅡA+30％FBS，分别培养24、48、72h后检测细胞增殖情况;倒置相差显微镜观察细胞形态学变化;伤口愈合实验观察VSMC迁移指数;免疫细胞化学法检测细胞血小板生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达变化;应用Western blot法观察细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及金属基质蛋白酶2(MMP2)、金属基质蛋白酶9(MMP9)的表达情况。 结果: 1.AVF失功的影响因素分析:内瘘失功组和通畅组在年龄、糖尿病肾病、血红蛋白、血清白蛋白、血小板、甘油三酯、血清铁、CRP(C反应蛋白)、血钾、血磷、PTH（甲状旁腺激素）等方面存在差异(P＜0.05); logistic回归分析显示患有糖尿病肾病(OR=1.551)，血清白蛋白(OR=1.061)、甘油三脂(OR=1.275)、血磷(OR=1.580)水平是内瘘失功的危险因素;内瘘失功组的生存分析显示糖尿病肾病患者内瘘的中位生存时间为7个月，非糖尿病肾病患者为27个月，差异显著(P=0.002);分别进行内瘘失功组和通畅组的组内比较，糖尿病肾病患者与非糖尿病肾病患者在血清白蛋白、甘油三酯、血磷方面存在统计学差异(P＜0.05)。 2.AVF血管内膜增生的机制研究:随着内瘘使用寿命的延长，各组内膜厚度逐渐增加，与慢性肾小球肾炎组相比，高血压肾损害组与糖尿病肾病组内膜厚度均明显增加，且糖尿病肾病组增加更为显著;HE染色显示增生血管内膜呈偏心性增厚，增生内膜处可见明显炎细胞浸润及空泡样变性;免疫组化染色表明，与慢性肾小球肾炎组相比，高血压肾损害组、糖尿病肾病组血管组织a-SMA、bFGF、IGF-1、MMP9的表达水平明显升高，VEGF表达显著降低，MMP2表达量无明显变化(P＞0.05)。一元回归分析发现a-SMA表达水平与bFGF、IGF-1、MMP9的表达存在明显正相关，与VEGF的表达呈负相关。 3.TanⅡA对VSMC增殖与迁移的影响:与增殖组相比，TanⅡA干预后细胞增殖明显缓慢，其抑制作用呈时间、剂量依赖性，20mg/l TanⅡA干预48h对VSMC增殖的抑制作用比较显著，且无明显细胞损伤。相差显微镜下观察可见5％FBS组和30％FBS组VSMC生长状态良好，30％FBS组细胞数量明显增多，细胞边界清楚，形态舒展宽大，排列规则。经TanⅡA处理后贴壁细胞数量随药物浓度的提高逐渐降低，10mg/l TanⅡA、20mg/l TanⅡ A组可偶见细胞收缩，40mg/l TanⅡA组细胞变圆、肿胀，胞核模糊，有大片细胞脱落区;伤口愈合实验显示TanⅡA干预后VSMC的迁移指数明显低于增殖组(P＜0.05);免疫细胞化学结果显示，与增殖组相比，TanⅡA干预后PDGF表达减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)，各组间bFGF表达无明显差异;Western blot结果显示，与增殖组比较，TanⅡ A干预组随药物浓度的提高，Bcl-2、MMP2、MMP9表达水平降低，Bax表达升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 结论: 1.原发病为糖尿病、血清白蛋白、甘油三酯、血磷水平是维持性血透患者AVF失功的独立危险因素，糖尿病肾病患者内瘘使用时间明显短于非糖尿病肾病患者，其影响因素与血清白蛋白、甘油三酯、血磷水平密切相关。 2.AVF内膜增生主要以VSMC增殖为主，VSMC的增殖可能与bFGF、IGF-1、MMP9的表达上调、VEGF活性抑制有关，高血压、糖尿病可加速血管内膜增生进程。 3.20mg/l TanⅡA对高浓度FBS诱导的VSMC增殖与迁移的抑制作用较为明显，且无明显细胞损伤，其抑制作用可能与调节Bcl-2、Bax表达，阻断PDGF、MMP2、MMP9蛋白因子活化有关。