近年来，我国性传播性疾病的发病率持续快速升高已严重危害我国人民的健康和家庭幸福。淋病是由淋病奈瑟菌感染引起的世界上发病率最高的性传播疾病之一。随着淋球菌耐药菌株不断增加，抗菌治疗日益困难。探讨淋球菌的致病机理，找到理想的淋病治疗和预防手段已成为我国迫在眉捷的大事。 据大量文献报道，淋病奈瑟菌进入机体后首先需粘附于泌尿生殖道上皮细胞表面，然后才能进入机体引起一系列病变，粘附是淋球菌致病的先决条件，一旦失去粘附能力，就不能引起淋病。进一步研究发现，淋球菌的外膜蛋白在细菌粘附中起了至关重要的作用。 淋球菌的外膜蛋白不仅与淋球菌致病机制有关，而且也可能是淋病疫苗的潜在免疫原。目前已知的淋球菌表面抗原有多种，其中Porin I(PI)是外膜蛋白中含量最高的蛋白成分，约占60％，仅有中等程度的抗原变异，且抗PI抗体具有杀菌作用，因而PI抗原理论上最有可能用于制备成功的淋病疫苗。我们成功地构建、表达并纯化了淋球菌外膜GST-PI融合蛋白，经鉴定证实该蛋白为淋球菌外膜PI蛋白特异性的，并初步进行了淋球菌粘附抑制试验，以观察家兔多价抗血清对淋球菌粘附上皮细胞过程的抑制作用。现将研究过程和结果报道如下。 方法 2002年浙江大学医学院硕士论文 （一人 重组体的构建 二、聚合萌链反应（PCR）及其产物的回收： 淋球菌外膜PI蛋白基因用PCR扩增。上游引物5’－－rH TCC ATG AAA AAA TCC CTG ATT GCC CTG－3’；下游引物 5’－CT’r AAG CTT AAA CAC hC GTC TGG CTG TGG－3’。PCR产物用 glass milk kit回收。 2、连接和转化： 将回收的PCR产物插入克隆载体T－Easy－Vector形成克隆重组体 （T－Easy－－Vector／PI）。测序鉴定后，将PI蛋白基因插入表达载体pGEX－4T－2 形成表达重组体（PGEX－4T－2／PI）。 （二L朋卜PI＄合蛋白的诱导及纯化： GST－PI融合蛋白的诱导主要按GST基因融合系统试剂盒说明书进行。 GST－PI融合蛋白可溶性分析显示该蛋白为非可溶性，故用SDS－－PAGE电泳、 切下融合蛋白条带、电洗脱回收等方法提纯。 （三人 重组蛋白的鉴定： 纯化回收的融合蛋白用斑点免疫层析试验鉴定。制备胶体金标记的滤 纸条，加一滴去离子水，5分钟后硝酸纤维素膜上出现一条紫红色条带，表 示该蛋白与PI蛋白单克隆抗体发生特异性结合。 （四人 淋球菌粘附抑制试验： 淋球菌粘附抑制试验：单克隆淋球菌斑分别重悬于lml DME比家兔抗 血清 0．5。l和 DMEM 0．sml的混合液、家兔抗血清 0．25ml和 DMEM 0．75ml 混合液中（上述DMEM不含抗生素）。淋球菌与抗血清先共同孵育半小时。然 后淋球茵与Heha细胞共同孵育3 ，J’时。弃培养液，用DMEM洗2次。革兰 氏染色，高倍油镜下观察结果。 结果与 结论 3 2002年浙江大学医学院硕士论文 1、淋病奈瑟菌外膜PI蛋白基因的鉴定： 我们克隆的淋病奈瑟氏菌外膜PI蛋白基因长度为约Ikb，将其测序结 果同PUbMed基因库中淋球菌外膜PI蛋白基因序列对照后，确定其序列与 GI“3925491”［GenBank］Neisseria gonorrhoeae相一致。 2、融合蛋白的诱导表达、可溶性分析及纯化： 我们将含表达重组体的大肠杆菌诱导前、诱导后的产物用 10AsDS－－PAGE进行凝胶电泳，考马斯亮蓝染色后观察发现：在分子量为约 60 000处，诱导后的大肠杆菌可见浓染条带，而诱导前的大肠杆菌则无浓 染条带。这表明我们诱导出的 GST－－PI融合蛋白的实际分子量为约 60 000。 而文献报道的GST蛋白分子量为约27 000，PI蛋白分子量为约33 000， 故 GST－PI融合蛋白推算分子量亦为约 60 000。所以我们纯化的 GST—PI融 合蛋白的实际分子量与推算分子量一致。 将诱导表达后的大肠杆菌经超声粉碎菌体，离心后取上清和沉淀作 SDS－PAGE分析，表明GST－－PI融合蛋白主要存在于沉淀中，故不能用常规亲 和层析法进一步纯化。所以我们用SDS－PAGE分离蛋白、考马斯亮蓝染色、 脱色液脱色、切下 60 000的蛋白条带、电洗脱回收等方法来纯化GSTWI 融合蛋白。 3、融合蛋白特异性鉴定： 斑点免疫层析试验结果显示紫红色条带