论文部分内容阅读
酵母营养丰富,其自溶物中包含核苷酸、生物活性多糖、抗氧化活性多肽及多种营养物质,被广泛应用于食品、化妆品等领域。温度是影响酵母自溶的重要因素之一,其影响酵母的自溶程度以及自溶物中活性物质的含量。并且在自溶过程中,热胁迫会导致酵母的蛋白质功能、细胞代谢等发生调控,引起酵母的压力应答。因此,选育高温敏感型酵母有助于促进酵母低温自溶、提高自溶物的生物活性和应用价值;同时,研究热胁迫应答对酵母自溶的影响能为选育优良酵母菌株以及研究热胁迫下酵母自溶的机制提供理论依据。本文建立了一种高温敏感型酵母的筛选方法,并以自溶能力较强的Pilsner啤酒酵母为出发菌株,选育获得了一株能够在较低温度下自溶并产生高活性自溶产物的突变菌P-510,利用转录组学和比较基因组学,分析了与热胁迫下酵母自溶相关的代谢途径和关键基因。主要研究结果如下:(1)高温敏感型突变菌的选育及筛选方法的建立:通过常压室温等离子体(ARTP)诱变和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(BCIP)平板筛选,建立了一种高温敏感型酵母的筛选方法。并以Pilsner啤酒酵母为出发菌株,获得了一株高温敏感型啤酒酵母P-510。突变菌P-510对高温敏感,在37℃表现出明显的生长抑制,72 h后死亡率达到87.8%。与出发菌株Pilsner相比,该菌更易发生自溶,自溶液的核酸抽提率、蛋白质抽提率、氨基酸态氮抽提率分别提高了142.8%、60.0%和10.9%。将该方法应用于面包酵母AQ和葡萄酒酵母D254中,也成功筛选到高温敏感型突变菌A-14和D-12。(2)高温敏感型突变菌P-510自溶产物特性研究:与菌株Pilsner相比,37℃下自溶时,P-510自溶产物中的5’-鸟苷酸(5’-GMP)和5’-肌苷酸(5’-IMP)含量均较高,且72 h和144 h后得到的自溶产物中呈味核苷酸含量(5’-GMP+5’-IMP)分别提高134.9%和193.4%;自溶36、84、132 h后,P-510自溶产物中β-葡聚糖溶出分别提高7.9%、30.0%和40.3%。同时,P-510在37℃下自溶产物的DPPH清除率在60 h达到最高值,比Pilsner在50℃和37℃下自溶分别提高13.3%和22.2%。对自溶物多肽组成分析发现,与50℃相比,37℃下自溶有利于获得小分子多肽。(3)热胁迫应答对酵母自溶的影响:相比于Pilsner,热胁迫下P-510的胞内腺苷三磷酸(ATP)和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)水平低、活性氧(ROS)积累高。通过转录组学分析突变菌和原始菌中热胁迫和基因突变造成的基因表达差异,发现在热胁迫下,P-510和Pilsner的基因表达调控不同,相比于Pilsner,P-510的三羧酸循环途径下调、糖酵解途径上调、磷酸戊糖途径下调和己糖转运途径下调。推测P-510的线粒体代谢受到抑制、糖原代谢紊乱、己糖转运调控异常,不利于细胞抵御热压力,从而造成了P-510对高温敏感。通过比较基因组学分析P-510中的突变基因,并结合转录组学数据分析,推测GRE1、RKI1、ERG5、NDE2、HXT7等22个基因可能是热胁迫下酵母自溶的关键基因。