研究背景及目的胶质母细胞瘤是神经胶质瘤中恶性程度最高的肿瘤,属于WHOⅣ级。其病理特点为血管内皮细胞高度增生,形成了大量的发育不成熟的血管,并且出现了大片出血和组织坏死区域。因此,高度血管化和内皮细胞增生也是被用来定义胶质母细胞瘤的特征之一[1]。近年来,胶质母细胞瘤发病率有了越来越高的趋势,而且其发生率占到了胶质瘤的70%左右,加之治疗手段有限,每年有大量患者因其死亡[2]。目前胶质母细胞瘤的发病因素尚不清楚,血管增生和细胞侵袭的机制也仍不明确,所以缺乏特异性的治疗手段。现阶段仍然是以手术切除为主,辅以放化疗的综合治疗手段。因此,进一步研究胶质母细胞瘤的病理机制,寻找更加特异性的治疗方法就显得尤为迫切。近年来有大量研究将肿瘤的发生发展与外泌体联系起来[3]。外泌体是一种具有细胞之间信息传递作用的纳米级微小囊泡,它是由细胞内体系统产生的多囊泡体(MVBs)与细胞膜溶合后释放至细胞外转化而来。其内包含蛋白质、micro RNA、m RNA等多种物质,通过将这些内容物转移至受体细胞,外泌体在细胞间远距离信号传递中发挥了非常关键的作用。研究证实肿瘤细胞能够产生显著高于正常组织的外泌体。在胶质母细胞瘤中,许多研究认为大量产生的外泌体能够促进肿瘤细胞增殖、新生血管形成、化疗药物耐受和免疫逃逸等的作用[4]。如果能够通过调控外泌体的分泌来达到影响肿瘤发生发展的目的,这将对于胶质母细胞瘤的治疗具有非常深远的意义。虽然有文献表明,缺氧、免疫反应等因素能够刺激肿瘤外泌体的释放,但肿瘤细胞内外泌体生成的分子生物学机制却还需要大量的深入研究。VMP1是一种囊泡膜蛋白,它的功能与细胞内参与物质运输的各种囊泡形成有关,主要包括细胞自噬和胞吞作用[5]。除了与囊泡运输相关以外,VMP1在胰腺癌、卵巢癌、结肠癌等多种肿瘤中也发挥着重要的作用[7]。如在胰腺癌中,VMP1的表达会增强癌细胞对化疗药物的抵抗[6]。而我们的研究首次发现VMP1在胶质母细胞瘤中的表达显著增高,更重要的是,肿瘤组织分离纯化的外泌体中可检测到大量VMP1的表达。因此,我们的研究目的是探索VMP1的是否直接参与了外泌体的形成,VMP1是否能够调控胶质母细胞瘤的外泌体分泌过程,这一调节作用对肿瘤的发生发展起到什么样的作用。通过研究这些问题,试图为胶质母细胞瘤的治疗提供新的药物靶点和治疗策略。研究方法:本课题首先收集GBM及其他级别胶质瘤患者标本,通过蛋白免疫印记和免疫组织化学等技术确定VMP1蛋白在GBM组织中的表达水平。然后运用免疫电镜技术观察VMP1在GBM细胞中的功能定位,再以此为依据进行细胞器的分离纯化以探明VMP1的亚细胞定位。其次,建立U251细胞的过表达和敲减VMP1的稳转细胞系,通过提纯其培养液外泌体并以蛋白免疫印记和粒径分析技术探索VMP1水平对外泌体分泌的影响。进一步地,我们在原代培养的GBM细胞以及U251细胞中运用免疫荧光双标技术研究VMP1与多囊泡体和外泌体标志性蛋白的共定位情况。在研究VMP1调控外泌体分泌的机制研究中,我们用过表达和敲减VMP1的稳转U251细胞建立自噬激活或抑制的模型,观察其外泌体的分泌量,借以确认VMP1的表达在抑制自噬降解多囊泡体从而促进外泌体分泌的作用。紧接着,我们在HUVEC细胞中验证VMP1调控后的U251细胞来源外泌体对血管内皮细胞增殖和成血管能力的影响,这部分研究运用了内皮细胞体外成管实验和大鼠动脉内皮出芽实验。最后,我们用过表达和敲减VMP1的稳转U251细胞建立了裸鼠颅内成瘤模型,在体验证VMP1对肿瘤生长的影响,并利用免疫荧光组织化学技术检测VMP1在肿瘤血管形成中的作用。研究结果:实验一:VMP1在胶质母细胞瘤患者组织中的表达显著升高。(1)通过比较GBM患者标本和较低级别胶质瘤组织以及瘤旁正常组织中VMP1表达水平,发现VMP1在GBM组织中表达急剧升高,而Ⅱ、Ⅲ级胶质瘤中VMP1与正常脑组织的差异并不明显。(2)GBM组织中VMP1只表达在GFAP阳性的瘤细胞中,而正常脑组织中的星形胶质细胞和神经元中都几乎无VMP1表达。(3)多种胶质母细胞瘤中VMP1的表达均高于正常星形胶质细胞。实验二:VMP1参与形成外泌体并调控了胶质瘤细胞外泌体的分泌过程。(1)通过构建GFP-VMP1转染U251细胞我们发现VMP1形成大量囊泡样结构,通过分离提纯肿瘤组织内的late endosome我们证实VMP1确实存在于late endosome中,免疫电镜观察进一步确认这一结构可能是多囊泡体(MVBs)。(2)通过免疫荧光双标技术,我们发现VMP1在原代GBM细胞内以及U251细胞内均能够与MVBs和外泌体的标志蛋白CD63、Alix和Rab27等共定位标记。(3)建立过表达VMP1和sh VMP1稳转U251细胞系,并提纯细胞培养液中的外泌体进行外泌体蛋白的定量分析我们发现VMP1能够促进外泌体的分泌,降低其表达会抑制GBM细胞产生外泌体,而且这一过程并不影响外泌体的形态。(4)过表达VMP1能够促进外泌体的标志性蛋白CD9、CD81在细胞内形成聚集的颗粒,并是CD81向细胞膜附近聚集。降低VMP1的表达会抑制这一过程。实验三:VMP1通过抑制MVBs的自噬降解途径促进外泌体的分泌。(1)饥饿条件激活U87和U251细胞自噬后,随着LC3Ⅱ的升高或降低,VMP1的变化与其相反,雷帕霉素激活细胞自噬能够引起VMP1水平的下降,说明VMP1与在自噬小体形成的过程中可能发挥相反的作用。(2)通过在细胞中过表达VMP1,LC3Ⅱ的含量明显下降,而sh VMP1后LC3Ⅱ的表达会上升,这证明VMP1会抑制自噬的活性。(3)用LC3双色荧光来指示自噬流活性,发现在过表达VMP1后,明显抑制了自噬溶酶体的形成。在雷帕霉素激活自噬后,VMP1过表达的细胞同样具有更低的自噬流活性。进一步验证VMP1会抑制自噬过程。(4)雷帕霉素激活自噬能够引起U251细胞外泌体的分泌减少,而过表达VMP1的细胞能够抑制激活自噬引起的外泌体减少。同时,sh VMP1能够消除阻断自噬活性引起的外泌体分泌增多。实验四:降低VMP1的表达能够通过减少外泌体的分泌减弱GBM新生血管的形成从而抑制肿瘤生长。(1)U251细胞来源的VMP1阳性外泌体在共培养条件下能够从U251细胞进入HUVEC人血管内皮细胞中,进而发挥促进HUVEC增殖和血管形成的作用。(2)通过大鼠动脉内皮出芽实验,发现过表达VMP1的U251细胞分泌的外泌体能够促进动脉内皮细胞的血管形成能力。(3)用阴性对照、过表达VMP1、sh VMP1稳转U251细胞在裸鼠颅内进行原位成瘤实验,发现过表达VMP1的细胞形成更大范围的肿瘤,而sh VMP1的细胞形成的肿瘤体积显著小于对照组,实验动物也拥有更高的生存率。(4)原位成瘤实验的肿瘤组织中,利用CD31、CD43和SMa来标记血管,结果发现sh VMP1细胞形成的肿瘤形成的血管数量显著少于对照组,而过表达VMP1细胞形成的肿瘤拥有更加丰富的血管组织。研究结论本研究通过研究VMP1在胶质母细胞瘤中的作用,得到以下结论:(1)GBM细胞内VMP1的表达显著升高,且明显高于其它级别胶质瘤。(2)VMP1是外泌体的组成成分,而且能够调控外泌体的分泌。(3)VMP1对GBM细胞自噬活性有抑制作用,并能够通过抑制MVBs的降解而促进外泌体的分泌。(4)VMP1能够通过促进GBM细胞分泌外泌体而促进血管内皮细胞增殖和血管形成。(5)降低VMP1表达能够显著抑制肿瘤的生长并提高模型动物的生存率。