表观遗传现象足一种由非DNA序列变化引起的，并且可以遗传的基因表达水平的变化，包括DNA甲基化，组蛋白乙酰化及染色质的构形改变等。DNA甲基化是影响表观遗传机制中的主要因素，在细胞分化、发育、增殖及凋亡过程中都起着非常重要的作用。从正常细胞变化到肿瘤是一个漫长的机理复杂的过程，涉及到多阶段、多步骤、多基因作用。肿瘤细胞中基因组总体甲基化状况异常变化，以及相关基因启动子区域发生过甲基化是肿瘤最早也是最常见的分子改变之一。DNA甲基化通常发生在基因组序列中的CG位点密集区域，称之为CpG岛，通常为基因5’端启动子区和第一外显子区。随着分子圣物学的发展，越来越多的科研成果证明，DNA甲基化现象直接与肿瘤发生发展过程中普遍发生的癌基因活化和抑癌基因的失活相关。由此，异常的基因启动子区域甲基化状态的检测可以作为肿瘤早期诊断以及传统治疗手段预后效果评估的一个临床医用分子标记。 骨肉瘤是青少年中最常见的实体恶性肿瘤之一，每年百万名青少年中有6人罹患此疾病。先前的很多研究表明，骨肉瘤经常发生在青少年骨骼最高速成长的时期，在相对身高偏高人群和男性中发病率较高，尽管如此，骨肉瘤的发生发展机制至今还不是非常清楚。很多科学家预测，骨肉瘤的发生和发展可能和成骨细胞不正常的生长代谢调控基因有关。研究骨肉瘤相关基因的启动子区域甲基化程度成为一个研究骨肉瘤发生发展机制和临床预后非常有意义的工作之一。 MethyLight技术是原有MSP(甲基化特异性PCR)技术和基于Taqman探针荧光定量PCR技术相结合的产物。可以用来高灵敏，高通量，高速度，高精度的对微量DNA样品的甲基化状态进行定量分析。DNA在亚硫酸氢盐作用下，未发生甲基化的胞嘧啶转C变成尿嘧啶U，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，这就人为的形成了甲基化和非甲基化DNA片断在序列上的差异。然后在一对位点特异的引物之间设计一个可与待测位点互补的探针，探针的5’端和3’端分别用报告荧光(如FAM)和淬灭荧光(如TAMRA)标记。如果探针可与待测位点杂交，那么在PCR延伸期间，Taq聚合酶5’到3’端的外切核酸酶活性会将探针5’端的报告基团切下，淬灭基团对其的抑制作用将消失，通过测定报告基团荧光信号的强弱即可判断出DNA的甲基化状态。这个方法同时具有MSP的特异性和灵敏性以及荧光定量PCR的快速和抗污染等特性，可对微量临床样本的甲基化进行定量检测。本文在30例骨肉瘤样本及相对应的正常样本中，选取了11个与肿瘤发生发展相关的基因包括抑癌基因CDKN2A、APC、．RASSFIM、ESRI、RARβ-2；DNA修复基因MGMT、TERT；肿瘤分子侵袭转移相关基因DAPK，TIMP3、THBS1；以及代谢酶基因MTHFR，对其启动子区域进行了基于上述MethyLight技术的相对定量甲基化分析。结果发现，这11种基因中的10种和正常组织相比都发生了明显的甲基化水平升高的现象。而将其甲基化水平累加后再次分析肿瘤组织和正常组织之间的甲基化水平差异，可以得到更加明显的结果，同时，在发生转移和不发生转移的患者样本中，在不同性别的患者样本中，我们也观察到了明显的甲基化水平差异。 在上述实验过程中，我们也发现了一系列的问题，随着基因芯片技术，实时荧光定量PCR技术等高通量高速度检测方法的运用，同时平行检测大量样本的同时，对实验中所需要DNA样本的数量提出了更高的要求这也成为了这些新技术广泛应用的障碍和瓶颈。同时来自于临床微创采样技术和法医采样的样本通常数量很少，采集和提取出的DNA含量难以满足现代检测技术的要求。本文率先提出了一个新的DNA样本扩增保存重复利用的技术。我们用生物素标记的6N随机引物(5’-biotin-NNNNNN-3’)利用Phi29DNA聚合酶高效率，高保真线性扩增的特点，对基因组进行线性扩增，得到5’端生物素标记的单链DNA片断。然后利用生物素和亲和素紧密稳定连接作用的特性使单链DNA片断结合在亲和素包被的磁珠上，可以在下游实验中(例如PCR实验等)重复多次利用。这种方法仅需要传统全基因组扩增方法所需时间的六分之一到三分之一，Phi29DNA聚合酶的高保真扩增特性还可以保证扩增片断和原始片断的高度一致，扩增片断的长度大多在2k以上，比较传统全基因组扩增方法，断裂更少，片断更完整，可以充分的保留原样本DNA的生物信息学信息。利用磁珠易富集，易分离的特性，这种方法还可以被广泛的应用到DNA萃取分离的步骤中，用于替代繁琐并产生高度损耗的乙醇低温沉淀技术。