生物素标签序列与耐高温错配碱基识别蛋白Tth MutS融合表达与功能鉴定

来源 :上海交通大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hdmlb2008
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错配修复系统MMR在维持遗传物质稳定性上起重要作用。错配识别蛋白MutS是MMR系统执行修复功能的第一个蛋白,具有识别并结合错配的能力。已经有许多报道利用MutS蛋白识别错配能力检测突变与SNP,以及增加合成基因保真度的研究。为了克服TthMutS蛋白质应用于SNP鉴定存在回收率低的缺点,我们表达并鉴定了生物素标签与耐高温Tth MutS蛋白融合表达的一种基因工程蛋白质。将PCR扩增和基因重组技术制造的编码这种融合蛋白的DNA片段分别克隆于PinPoint表达质粒和pET表达质粒。尽管两种表达系统都能表达该融合蛋白,但是1升LB培养液经过相应的亲和层析纯化后所获得的融合蛋白量不同。pET表达系统能够产生1毫克以上的融合蛋白,而PinPoint表达系统只能产生100微克的融合蛋白。链霉亲和素结合实验表明C-端融合的TthMutS蛋白质不影响生物素标签的生物素修饰,大肠杆菌几乎能够完全将这样的标签序列生物素化。DNA结合实验证明,N端的生物素标签序列和C端的His标签序列都不影响耐高温TthMutS蛋白质结合误配碱基的能力。考虑到(1)生物素-链霉亲和素是一种理想的捕获系统、(2)生物素标签对于TthMutS的活性几乎没有影响、和(3)MutS在SNP鉴定方面有潜在用途,我们基因工程生产的这种融合蛋白可能显著改进现有的基于MutS检测SNP的技术。
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