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目的:应用基因转染及RNA干扰等分子生物学手段,从Nrf2-ARE信号通路的角度探讨DJ-1上调H9c2心肌样细胞内抗氧化酶(MnSOD、CAT、GSH-Px)的表达,对抗缺氧/复氧(H/R)所诱发的氧化应激损伤的分子机制。方法:1、H9c2心肌样细胞分别经DJ-1 siRNA、阴性对照siRNA(NC siRNA)、pFlag-DJ-1重组载体及其相应的对照空质粒pFlag瞬时转染24 h后,通过Western blot检查DJ-1蛋白、抗氧化酶MnSOD、CAT、GPx蛋白表达的变化,以求观察DJ-1不同表达水平对H9c2细胞内抗氧化酶MnSOD、CAT、GPx蛋白表达的影响。2、H9c2心肌样细胞分别经DJ-1 siRNA、NC si RNA、pFlag-DJ-1、pFlag瞬时转染24 h后,建立H/R模型,通过检测以下变化,探讨DJ-1不同表达水平对H/R所诱发的氧化应激损伤的影响:(1)MTT法检测各组心肌细胞存活率的变化;(2)利用试剂盒检测各组细胞内LDH活性的变化;(3)应用比色法测定MDA含量的变化;(4)流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)含量的变化。3、H9c2心肌样细胞分别经DJ-1 siRNA、NC si RNA、pFlag-DJ-1、pFlag瞬时转染24 h后,通过检测以下变化,观察DJ-1不同表达水平对H9c2细胞内Nrf2信号通路的影响:(1)Western Blot检测细胞内DJ-1蛋白表达的变化;(2)免疫共沉淀(Co-IP)检测Nrf2-Keap1的解离情况;(3)Western Blot检测Nrf2核转位变化;(4)染色质免疫共沉淀(ChIP)法检测胞核内Nrf2与MnSOD、CAT及GPx基因启动子区内抗氧化反应元件(ARE)结合的变化;(5)采用荧光素酶报告基因实验检测Nrf2的转录活性的变化。4、H9c2心肌样细胞经pFlag-DJ-1或pFlag瞬时转染24 h后,再分别用Nrf2siRNA或NC siRNA转染24 h,随后,采用Western Blot检测细胞内Nrf2及抗氧化酶(MnSOD、CAT、GPx)蛋白表达的变化,以此来观察抑制Nrf2信号通路对DJ-1所介导的H9c2细胞内MnSOD、CAT、GPx蛋白表达上调的影响。5、H9c2心肌样细胞经pFlag-DJ-1或pFlag瞬时转染24 h后,再分别用Nrf2 siRNA或NC siRNA转染24 h,随后,建立H/R损伤模型,通过检测以下方面变化,观察Nrf2信号通路的抑制对DJ-1抗H/R所诱发的氧化应激影响:(1)应用MTT法来检测实验各个组心肌细胞存活率的变化;(2)利用试剂盒检测各个组细胞内LDH活性变化;(3)采用比色法来测定MDA含量的变化;(4)流式细胞术检测细胞内ROS含量的变化。结果:1、H9c2转染pFlag-DJ-1后DJ-1蛋白水平明显提高,细胞内抗氧化酶MnSOD、CAT及GPx蛋白表达水平均显著上调;同时,pFlag-DJ-1转染可明显的提高H/R损伤心肌细胞的生存率,且抑制LDH的活性;并能够明显的减少H9c2心肌细胞H/R的过程中所生成的ROS,减少MDA产生。然而在siRNA干扰H9c2细胞内DJ-1蛋白表达后,上述效应被逆转,提示DJ-1能诱导细胞内抗氧化酶MnSOD、CAT及GPx的表达,对抗H/R所诱发的氧化应激损伤。2、在pFlag-DJ-1转染的H9c2细胞,胞质内Nrf2与Keap1的结合减少,Nrf2入核增加、并与核内SOD、CAT及GPx基因区的ARE的结合加强,同时Nrf2的转录活性明显增加;而在DJ-1 siRNA转染的H9c2细胞,DJ-1沉默对Nrf2-Keap1的解离及随后Nrf2的入核、与ARE的结合及其转录活性均呈现显著地抑制效应。这些结果提示DJ-1在心肌细胞能促进Nrf2信号通路的激活。3、H9c2细胞经Nrf2 siRNA转染抑制Nrf2信号通路后,DJ-1高表达上调抗氧化物酶SOD、CAT、GPx蛋白表达,对抗H/R所诱发的氧化应激损伤的效应均被逆转,提示Nrf2-ARE信号通路的激活是DJ-1蛋白上调抗氧化酶、对抗H/R诱发的氧化应激的关键机制。结论:DJ-1能通过激活Nrf2-ARE抗氧化信号通路,诱导Nrf2所依赖的抗氧化酶(SOD、CAT及GPx)的表达,从而有效对抗心肌细胞H/R所诱发的氧化应激损伤。