氧化铁纳米粒子的磁热效应及在黑质和细胞内的分布研究

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以聚乙二醇(PEG)为溶剂及反应剂,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚乙烯亚胺(PEI)为添加剂,乙酰丙酮铁(Fe(acac)3)为铁源,采用改进型的多元醇热解法来制备生物相容性较好、大小均一且粒径可控(615nm)的超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIONs)。利用不同粒径大小的SPIONs,研究SPIONs在交变磁场(ACMF)中的磁热效应,以及对SPIONs表面进行改性来调整SPIONs表面的物理化学性质:利用物理吸附法将二肉豆蔻磷脂酰胆碱(DMPC)修饰在PVP/PEG-SPIONs表面,制备成DMPC/PVP-SPIONs;利用化学交联法将链霉亲和素(SA)修饰在PEI/PEG-SPIONs表面,制备成SA/PEI-SPIONs。通过对纳米粒子表面进行改性,使其在与生物体之间发生相互作用时达到预期的效果。主要研究工作如下:(1)通过改变回流温度和回流时间来调控纳米粒子的粒径大小,将不同粒径的SPIONs分散于去离子水中,得到不同浓度的SPIONs分散液,将其置于频率为425 kHz,磁场强度为5.3 kA/m的ACMF中进行磁热升温实验。本工作探讨了比能量吸收率(SAR)与SPIONs粒径之间的关系,计算了布朗弛豫时间及尼尔弛豫时间。研究发现,SPIONs分散液的升温速率与SPIONs的粒径大小之间具有正比的关系,且SPIONs粒径越大,SAR值越高,最高可达到810 w/g;(2)采用多元醇热解法制备PVP-SPIONs,并在此基础上合成DMPC/PVP-SPIONs,通过材料表征证明DMPC成功地修饰在PVP-SPIONs上。利用脑立体定位注射的方法将两种纳米粒子分散液注入SD大鼠黑质部位,分别于24 h和1周后取出鼠脑。经过透射电子显微镜(TEM)观察发现,注射DMPC/PVP-SPIONs24 h后的黑质样品能明显观察到纳米粒子分散在突触、轴突终末、髓鞘以及胞内的溶酶体、细胞质。注射了PVP-SPIONs的样品只发现纳米粒子分布在胞腔或溶酶体中,而胞外几乎没有发现纳米粒子。注射两种纳米粒子1周后的黑质中均未发现明显的纳米粒子。结合ICP-OES的结果,同等时间下DMPC/PVP-SPIONs在黑质部位存留的量少于PVP-SPIONs。这是由于DMPC与细胞膜相似的结构使纳米粒子穿过细胞的效率增加,更容易进行脑内运输,因此黑质内存留的铁含量比PVP-SPIONs少。另一方面,将PVP-SPIONs与DMPC/PVP-SPIONs分别与PC-12细胞一起培养,结果发现,DMPC/PVP-SPIONs更容易进入细胞,而PVP-SPIONs在胞内则较少。这是因为在体外培养的过程中,由于DMPC的磷脂结构,使纳米粒子更容易进入细胞;(3)磁性纳米粒子在细胞膜上的有效附着对细胞膜TRPV1通道的激活起着重要作用。将链霉亲和素(SA)成功地修饰在PEI-SPIONs表面,形成具有高胶体稳定性和低细胞毒性的SA/PEI-SPIONs。XPS、紫外、FT-IR等测试分析结果证明SA成功修饰在PEI-SPIONs表面。将PEI-SPIONs、SA/PEI-SPIONs与PC-12细胞在含有0.2 mg/L生物素的RPMI 1640完全培养液中共孵育12 h,收集和固定细胞,利用TEM观察纳米粒子在亚细胞的分布状况。结果表明,PEI-SPIONs主要分布在胞内溶酶体,与前者不同的是SA/PEI-SPIONs清晰地附着在细胞膜上,这可以归因于SA与生物素位点之间的特异性结合。本工作提供了一种简单的方法,通过在含有生物素的培养基中培养细胞,将SA修饰的纳米颗粒附着在细胞膜上;(4)本工作将荧光素FITC结合的SA修饰在PEI-SPIONs表面,将FITC-SA/PEI-SPIONs脑立体定位注射入AVV-DIO-ChR2-mCherry转染的转基因小鼠黑质内,利用荧光标记技术与TEM共同研究纳米粒子在有生物素参与下的黑质内分布状况。研究发现在有生物素存在的黑质多巴胺能神经元周围发现纳米粒子,说明生物素与SA之间的强结合力可以提高纳米粒子的附膜效率。在本工作中使用的纳米粒子毒性较低、生物相容性好,并且通过简单地为黑质提供微量生物素的方法,使SA修饰的纳米粒子附着在细胞膜上的量明显增加,并验证了这种方法对于纳米粒子在体内/体外附着于细胞膜的适用性是可行的。
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