长期以来，急性和慢性排斥反应一直是困扰组织器官移植的一大难题，应用免疫抑制剂的方法有许多明显的毒副作用。目前认为解决这些问题的关键是在于诱导受体对供体组织器官的免疫耐受。 免疫豁免提出已有100多年历史，机体组织器官中迄今仅发现脑、眼角膜、睾丸、胎盘等组织器官为免疫豁免部位。现有的研究证实产生免疫豁免部位组织中某种细胞持续表达FasL是引起免疫豁免的重要原因之一。这一机制的发现，为移植免疫耐受的研究另辟新径，具有重要的意义。 睾丸支持细胞(Sertoli细胞)高表达FasL是睾丸成为免疫豁免器官的重要原因之一。本研究拟通过移植肝脏嵌合睾丸Sertoli细胞的方法，使移植肝脏高表达FasL，观察该方法对大鼠肝移植免疫耐受的诱导作用。 实验一：睾丸Sertoli细胞的制备及其对淋巴细胞的影响 目的：探讨睾丸Sertoli细胞分离纯化的方法及其体外对淋巴细胞免疫功能的影响。方法：①睾丸Sertoli细胞分离纯化：32只雄性SD幼鼠随机分为4组，每组8只，采用两种消化和两种筛网过滤方法，从睾丸组织分离Sertoli细胞。A组：用2.5g／L胶原酶V消化，两次筛网过滤。B组：用2.5g/L第四军医大学博士研究生学位论文 中文摘要胶原酶V消化，一次筛网过滤。C组：用工刀g／L胶原酶V消化，两次筛网过滤。D组：用 2．og／L胶原酶V消化，一次筛网过滤。对分离纯化的睾丸 Sertoli细胞进行记数，判断晕丸Sertoli细胞的活性；②细胞毒实验：取Wstar大鼠脾淋巴细胞 IX 106／ml，接种于 96孔培养板上孵育48h石D大鼠睾丸 Sertoli细胞经15GY 照射1卜，然后将IX f／ffilM组）、IX 10‘／ml＊组）、IX且／＊l （C组）和先经 FasL－mAb共同培养 30min的 IX 10＼ml（D组）晕丸 Sertoli细胞，分别加入含脾细胞的培养板内，再培养4～6h后，MTT比色法测OD值，判断睾丸Sertoli细胞对活性淋巴细胞的细胞毒作用。结果：①每只幼鼠获得的睾丸 Sertoli细胞数，A、B、C、D组分别为：（．95士 0刀6）XI 06个、（0．60士0．06）XIO‘个、（l．03士0．09） XIO‘个和（0．50士0．23）X 10‘个；存活率（O）分别为：88．8士2．5、89．7士2．7、89．8士二．3和 88．3土3．2。A组和 C组获得细胞数明显多于B组和 D组（P＜0刀1），其中 C组所获SOrtoli细胞数最高，达1刀3士0．09X 106个。四组中的睾丸 Sertoli细胞存活率相似，均在 88％以上；②体外宰丸Sertoli细胞对淋巴细胞有明显的毒性作用，各组比较有显著性差异J＜0刀1人随着 SCrtoli细胞数量的增加及共培养时间延长毒性作用逐渐增加，当 Sertoli细胞数量增加至 IX 106／ml、共培养 3d时作用最明显，以后这种作用不再增强而维持在一较高水平：结论：睾丸组织采用2．og／L的胶原酶V消化后，两次筛网过滤可获取数量较多的睾丸Sertoli细胞，并且可节省25％的胶原酶V，但不影响睾丸Sertoli细胞的存活率；体外Sertoli细胞对淋巴细胞的杀伤或抑制作用与Sertoli细胞数量和共培养时间有关。 实验二：嵌合睾丸SC悦d5细胞肝脏模型的建立 目的：建立嵌合Sertoli细胞肝脏模型，拟将嵌合Sertoli细胞肝脏作为供肝进行移植做准备。方法：60只 SD雌性大鼠随机分为 6组，每组 10只。在无菌操作开腹直视下经门静脉注入Zml Sertoli细胞，A组：生理盐水：B组：培养宰丸 Sertoli细胞的上清液；C组：Sertoli细胞 ZX 10’个；D组：2X106个；E组：ZX10’个，F组：2X108个。两周后取肝组织：免疫组化法 4第四军医人学博士研究生学位论文 中文摘要Y染色体检测，判断肝内嵌合 Sertoli细胞数；QRTICR法检测肝组织 FasLInRNA表达相对含量。结果：肝内嵌合Sertoli细胞数量C、D、E、F组分别为：47石土14．2、54．5士15．8、68．吕士22．0和67．4上23．8，E组和F组与C组和 D组有显著差异（P＜0．05）；肝组织中 FasL mRNA表达相对含量 A、B、C、D、E、F组分别为：0．185士0刀41、0．202士0．044、0238士0刀43、0．245士0刀37、0．427士0刀45、0．429士0刀35，C组和D组与A组和B组及E组和F组有显著差异（P＜0．05），E组和F组与A组和B组相差非常显著（P＜0．01）。结论：Sertoli细胞经门静脉肝内注入可在肝脏内嵌合，嵌合数量及肝组织中FasL mRNA相对表达含量，与注入数量有关，当注入数量超过 2 XIO’个，嵌合数量及 FasL mRNA相对表达含量不再升高。 实验三：受体肝分步切除的“二袖套” 法大鼠原位肝移植模型的建立 （大鼠原位肝移植模型的改进） 目的：改进二袖套法大鼠原位肝移植操作方法，使该模型能够普及应用。方法：共施行78例大鼠原位肝移植，其中34例采用传统方法，44例采用改进术式，对两种术式的操作时间、无肝期以及手术成功率等进行比较。结果：采用改进术式，肝下下腔静脉和门静脉吻合时间均不到lmin，无肝期和受体手术时间分别缩短至 14 min和 37 min左右