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目的:海洛因成瘾是一种以易复发为特征的慢性脑病,研究表明海洛因成瘾的发病学基础是海洛因长期暴露后所致的大脑结构与功能的适应性改变:如与学习和记忆环路的受损以及脑内神经元可塑性和信号分子的表达改变。迄今为止,针对海洛因依赖者的治疗手段主要仍是控制阿片戒断综合症,但缺乏有效的抗海洛因复吸措施。如果能寻找到较特异的生物标记物,可以指导和有效干预复吸行为。mi RNA是一类长约22个核苷酸大小的非编码RNAs,可以调控靶基因的翻译,与药物成瘾密切相关,目前关于mi RNA与海洛因复吸行为之间的神经生物学机制研究比较少。本课题选择mi R-206为目标深入探索它对海洛因复吸行为的影响,同时系统观察它对相关靶基因表达影响旨在明确伏隔核mi R-206在大鼠海洛因复吸行为中的主要调控机制。实验结果:实验一通过基因芯片分析海洛因大鼠的伏隔核mi RNA表达谱,完成mi RNA的筛选和靶向分析SD雄性大鼠进行连续14天的海洛因自身给药训练(FR1,海洛因浓度0.05mg/injection/kg)。实验大鼠分3组:空白对照组(Control,n=3)、戒断1天后线索诱导复吸组(CS1,n=3)、戒断14天后线索诱导复吸组(CS14,n=3)。CS1组和CS14组分别于戒断1天和戒断14天后行线索诱导复吸行为测试,在行为测试结束后迅速断头取脑部伏隔核组织,3组样本统一送基因公司进行mi RNA表达谱分析,完成基因芯片的筛选工作,本实验重点遴选戒断后表达增加的mi RNA。targetscan靶向分析方法:通过在线数据库:mi Rbase,Targetscan,mi RWalk,microcosm Targets等数据库,搜索mi R-206结合的靶基因,查阅文献了解靶基因的相关作用。结果:通过基因芯片技术,得到一系列mi RNA的表达谱,从中挑选出在CS1d与CS 14d表达有差异的mi RNA,参阅大量文献,选择研究对象mi R-206。通过分析确定mi R-206目标蛋白为BDNF/Me CP2/GABBR1。实验二验证海洛因成瘾大鼠伏隔核mi R-206的表达方法:实验大鼠分3组:空白对照组(Control,n=4)、戒断1天后线索诱导复吸组(CS1,n=4)、戒断14天后线索诱导复吸组(CS14,n=4),Control组于戒断第1天断头取伏隔核组织,CS1组大鼠于海洛因戒断第1天测复吸行为后断头取脑部伏隔核,CS14组大鼠于戒断14天后测复吸行为断头取脑部伏隔核提取RNA,通过q RT-PCR实验技术验证mi R-206的表达与基因芯片的分析结果是否一致。结果:单因素方差分析发现,q RT-PCR实验结果中mi R-206的表达在组间有统计学差异(F(2,10)=5.44,P<0.05)。相比于Control组,CS1组大鼠伏隔核的mi R-206表达明显增加(P<0.05);与CS1组相比,CS14组的大鼠伏隔核处mi R-206的表达明显升高(P<0.05)。此实验结果与基因芯片分析的mi R-206表达谱一致。实验三观察海洛因成瘾大鼠的伏隔核不同程度表达mi R-206-3p对线索诱导的大鼠复吸行为的影响,并检测目的蛋白的表达方法:将成功建立海洛因自身给药的34只海洛因大鼠根据有效鼻触随机分为4组:14天戒断的线索诱导复吸组(CS14,n=8),阴性对照组(LVGFP,n=8),mi R-206过表达组(LV-mi R-206-3p,n=9),mi R-206低表达组(LV-mi R-206-3p inhibition,n=9),借助大鼠脑立体定位技术,分别于自身给药训练结束后的2天内将LV-GFP、LV-mi R-206-3p、LV-mi R-206-3p inhibition慢病毒注入对应组别大鼠的伏隔核部位,术后连续给予3天青霉素(I.m,qd,400000 U/kg),戒断14天后4组大鼠统一进行2小时的线索诱导复吸行为测试,观察mi R-206-3p不同程度的表达对大鼠海洛因复吸行为的影响。随后断头取脑部伏隔核,通过q RT-PCR实验检测mi R-206-3p的表达水平(每组4-5只),应用Western blot实验检测BDNF/Me CP2/GABBR1的表达。结果:单因素方差分析发现,组间有效鼻触有统计学差异(F(3,32)=3.42,P<0.05),而无效鼻触没有统计学差异(P>0.05)。两两比较显示,LV-mi R-206-3p inhibition组的有效鼻触相比LV-GFP组显著增加(P<0.05)。q RT-PCR实验中mi R-206的表达在组间有统计学差异(F(3,13)=30.86,P<0.05)。于此同时,单因素方差分析发现各组间BDNF的表达水平(F(2.12)=29.75,P<0.05)、Me CP2的表达水平(F(2.12)=3.90,P<0.05)和GABBR1蛋白表达水平(F(3,14)=46.96,P<0.05)均有统计学差异。与LV-GFP组比较,LV-mi R-206-3pinhibition组BDNF和Me CP2表达水平均明显增加(P<0.05),而GABBR1蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。实验四抑制伏隔核mi R-206-5p的表达对线索诱导大鼠复吸行为的影响方法:成功建立24只海洛因成瘾大鼠,根据有效鼻触随机分为3组:14天戒断的线索诱导复吸组(CS14,n=8),阴性对照组(LV-GFP,n=8),mi R-206-5p抑制组(LV-mi R-206-5p inhibition,n=8),借助大鼠脑立体定位技术,于成瘾训练结束后1天内将LV-mi R-206-5p inhibition、LV-GFP病毒注入对应组别大鼠的伏隔核部位,术后进行连续3天的青霉素肌注(400000 U/kg),戒断14天后3组大鼠统一进行2小时的线索诱导复吸行为测试,观察大鼠海洛因复吸行为的变化。结果:通过线索诱导的行为学测试发现伏隔核低表达mi R-206-5p对大鼠有效鼻触数没有统计学差异(F(2.22)=0.97,P>0.05),表明对复吸行为并无明显调控作用。实验五大鼠伏隔核部位消减Gabbr1对海洛因复吸行为的影响方法:成功建立26只大鼠海洛因成瘾模型,根据有效鼻触随机分为3组:戒断14天线索诱导复吸组(CS14,n=8),阴性病毒组(LV-GFP,n=9),Gabbr1表达抑制组(LV-si RNA-Gabbr1,n=9);LV-GFP组和LV-si RNA-Gabbr1组均于戒断2天内在伏隔核微注射相应的慢病毒载体,3组大鼠统一在戒断14天后进行CS 2h的复吸测试,并灌流脑组织,观察病毒转染效率。结果:通过CS 2h的行为学测试发现伏隔核低表达Gabbr1对大鼠有效鼻触数没有统计学差异(F(2.24)=1.20,P>0.05),表明对大鼠海洛因复吸行为并无调节作用。实验六对海洛因成瘾的大鼠伏隔核过表达Me CP2,观察其复吸行为变化方法:成功建立24只大鼠海洛因成瘾模型,据有效鼻触随机分成3组:戒断14天诱导复吸组(CS14,n=8),阴性病毒组(LV-GFP,n=8),Me CP2过表达组(LV–Me CP2,n=8),LV-GFP组和LV-Me CP2组均于戒断第1天通过立体定位技术,在伏隔核处注入等量的慢病毒。3组大鼠在戒断14天后统一进行CS 2h复吸测试,并断头取伏隔核组织,分别进行后续的q RT-PCR及Western-blot实验。结果:单因素方差分析发现,成瘾大鼠各组间有效鼻触有统计学差异(F(2,22)=3.57,P<0.05),无效鼻触没明显差异(P>0.05),各组间BDNF的表达水平有统计学差异(F(2.12)=25.65,P<0.05),各组间Me CP2的表达水平亦有统计学差异(F(2.12)=11.01,P<0.05)。与LV-GFP组比较,LV-Me CP2组的BDNF和Me CP2表达水平均明显增加(P<0.05)。实验七双荧光素酶实验检测mi R-206与Me CP2基因的调控关系方法:实验分为6组:control+mi RNA-206、control+mi RNA-206-NC、Me CP2WT+mi RNA-206、Me CP2WT+mi RNA-206-NC、Me CP2MU+mi RNA-206以及Me CP2MU+mi RNA-206-NC;将0.1μg Me CP2基因的质粒(control,Me CP2WT,Me CP2mutant)、0.4μg mi RNA-206质粒(mi RNA-206和mi RNA-206NC)和0.02μg Renilla质粒通过ROCHE试剂盒转染于293T细胞,转染48h后,Promega检测各组荧光值。观察mi R-206对Me CP2WT组荧光蛋白表达的影响。结果:Me CP2WT+mi RNA-206组和Me CP2WT+mi RNA-206-NC组的荧光表达量比较有所减少(P=0.025)。结果提示mi R-206可直接部分抑制Me CP2基因的表达。结论:本研究发现海洛因成瘾戒断14天后伏隔核mi R-206的表达升高,而抑制mi R-206后大鼠海洛因复吸行为增强,结果提示戒断后伏隔核mi R-206的表达对海洛因复吸行为具有保护性作用。通过对预测的mi R-206调控的目的基因进行验证分析,表明mi R-206对BDNF和Me CP2的表达有调控作用;抑制mi R-206后Me CP2表达增高,双荧光素酶实验发现mi R-206轻度调控Me CP2的表达,因此,mi R-206可能靶向调节BDNF和Me CP2的表达起到对复吸行为的保护作用。