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本文主要研究内容是从菌株中筛出能够高产淫羊藿苷糖苷酶的菌株,从而能将多糖基的淫羊藿苷水解成低糖基的淫羊藿苷。并且对微生物产的糖苷酶进行分离提纯,以及提纯酶的分子量确定、酶性质、酶反应特性、酶反应动力学等方面进行了研究。
首先,确定淫羊藿总苷的最适薄层层析展开剂是乙酸乙酯:丁酮:甲醇∶水=10:1∶1∶1。之后确定了高产淫羊藿苷糖苷酶的菌株为Absidia sp.E9r。进一步研究表明:淫羊藿苷糖苷酶的最适诱导物是浓度为25%;最适发酵时间为120小时。
发酵粗酶液经硫酸铵沉淀、透析后,选用0.02M pH4.0缓冲体系下的DEAE-CelluloseDE52柱(φ2.0×9.0)进行梯度洗脱,可得到提纯酶。提纯酶用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行了纯度检测及蛋白分子量测定,确定此淫羊藿苷糖苷酶的酶蛋白的分子量为:61kDa。
本实验对提纯酶的反应条件进行了探索,淫羊藿苷糖苷酶的最适反应条件为:pH值4.0,在pH稳定性在pH3.0~6.0区域范围内较稳定;反应温度50℃,40℃~60℃温度稳定性较好;底物浓度20mg/mL,反应时间20小时。在淫羊藿苷糖苷酶的酶反应中:Na+、K+两种金属离子具有活性作用;Mg2+、Cu2+对酶反应的影响不大;Zn2+、Fe3+、Ca2+三种金属离子有抑制作用。酶反应动力学研究,得到米氏方程:1/V=142.95/S+18.416,最大反应速度Vmax=5.43i0×10-2μmol/h,米氏常数Km=2.52mol/L。
淫羊藿苷糖苷酶的酶反应特性的研究表明,淫羊藿苷糖苷酶具有水解淫羊藿苷侧链上的鼠李糖基的特异性,是专一酶。
最后进行大批量酶反应,产品进行TLC检测,淫羊藿苷的转化率较高,并且酶反应后仍存活60%。