鸡传染性支气管炎(Infectiolls BronchitiS,IB)是由冠状病毒科(Comnavrindac)冠状病毒属(Comnavirus)的传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病,是威胁集约化养鸡场的主要疫病之一。在传染性支气管炎病毒的检测中,传统的分离培养、琼脂扩散试验(AGP),血凝试验(HA)与血凝抑制试验(HI),免疫荧光试验(IF),免疫扩散(ID),酶联免疫吸附试验(ELISA),斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)及中和试验(VN)等是研究者一直采用的方法。这些血清学检验具有良好的特异性和敏感性,操作简便,但由于IBV的血清多型性和不同毒株抗原交叉关系复杂,所以标准很难统一。因此,快速、灵敏、特异性强的PCR技术近年来被广泛应用于动物传染性疾病的检测。但常规PCR技术需很多后续处理,也容易造成实验室及PCR产物的污染。TaqMan实时荧光PCR技术是在普通PCR基础上加入一条TaqMan探针,该探针能在PCR的每个循环与靶序列进行特异性杂交,有效提高反应特异性和灵敏度,更好地避免假阴性结果,使PCR技术检测痕量样品的能力进一步加强。本研究依据传染性支气管炎病毒S基因序列的多态性设计TaqMan探针及特异性引物,分别对该病菌进行常规PCR及实时荧光PCR检测。特异性引物及TaqMan探针能检测出所有供试的传染性支气管炎病毒,其它对照病毒均无电泳条带也未收集到荧光信号,显示出该引物—探针组合有很强的特异性。通过对不同浓度病毒液的常规PCR和实时荧光PCR扩增,发现实时荧光PCR检测灵敏度比常规PCR高约100倍,能很好地避免假阴性结果。以接种7日龄雏鸡进行人工气管内感染,从气管分泌物提取核酸作为模板,常规PCR方法能在接种后第36小时检测到该病毒,而实时荧光PCR则可以在接种后第10小时就检测到该病毒的存在。通过对鸡胚肾细胞传代的鸡传染性支气管炎病毒的测试发现,肾细胞的核酸对IBV PCR扩增不存在抑制作用或抑制作用微弱,完全可以通过实时荧光PCR技术获得准确的试验结果。将鸡胚尿囊腔接种的IBV的核酸作为模板进行PCR扩增,实时荧光PCR的相对灵敏度明显高于常规PCR。本研究可直接应用动物细胞的总RNA作为试验材料,无需进行病毒的分离培养及性状观察。由于采用光电传导系统和计算机操作系统能够很直观地反映出整个PCR过程各个反应阶段的信息,而且不需要进行PCR产物的后续处理,可以提高检测效率,减少污染。本研究在国内首次建立了对IBV的TaqMan实时荧光PCR检测体系,并获得很好的检测结果。该方法快速、灵敏、特异、安全,能及早提供准确的IBV感染信息,为鸡传染性支气管炎的诊断和防治提供有力的技术支持。