【摘 要】
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随着无抗养殖时代的到来,益生菌作为替代物被广泛使用。芽孢杆菌属具有功能全面、存在性广和抗逆性强的特点,是应用最广泛的益生菌种类之一。但是,商品与标签标注不符事件频发,且施用益生菌对水产养殖及自然环境水体细菌群落的潜在风险尚不清楚。因此,本研究以商用复合芽孢杆菌为研究对象,检测其与标签的相符程度。探究其在不同使用浓度下对养殖水环境的细菌群落结构的影响。以及在综合养殖系统中持续使用后,含芽孢杆菌的养殖
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随着无抗养殖时代的到来,益生菌作为替代物被广泛使用。芽孢杆菌属具有功能全面、存在性广和抗逆性强的特点,是应用最广泛的益生菌种类之一。但是,商品与标签标注不符事件频发,且施用益生菌对水产养殖及自然环境水体细菌群落的潜在风险尚不清楚。因此,本研究以商用复合芽孢杆菌为研究对象,检测其与标签的相符程度。探究其在不同使用浓度下对养殖水环境的细菌群落结构的影响。以及在综合养殖系统中持续使用后,含芽孢杆菌的养殖废水对河流自然水体细菌群落的结构与功能的作用进行了系统的评价。主要研究结果如下:1.对复合芽孢杆菌菌株进行分离鉴定,其主要成分为枯草芽孢杆菌KC-1与解淀粉芽孢杆菌J-19,与商品标注(枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)不完全符合。经鉴定,其有效活菌数为(2.26±0.43)×1012cfu/g、芽孢数为(2.67±0.80)×10~7cfu/g,含量符合商品标注。同时,KC-1和J-19具有良好的产纤维素酶和蛋白酶能力,溶血性分别表现为α-溶血和无溶血性。使用药敏试纸进行抗生素敏感性测定,KC-1和J-19均对米诺环素产生耐药。此外,KC-1对红霉素、新霉素、头孢哌酮、羧苄西林、苯唑西林和青霉素中度敏感,J-19对新霉素、头孢哌酮和羧苄西林中度敏感。使用KC-1对斑马鱼和罗非鱼进行注射,通过观察与病理切片展示,注射组的鱼均未出现异常现象及死亡,组织无明显病变。2.在罗非鱼养殖水体中添加不同浓度的芽孢杆菌制剂,实验设置从高到低6个浓度的添加组(A-F组)与对照组CK,在添加芽孢杆菌后第1天(OD)、第3天(TD)、第7天(SD)采集样品。采用中国环境保护标准方法对水质进行评价,结果发现对照组CK的NH4+-N、TP、NO2--N和NO3--N浓度均高于添加芽孢杆菌的实验组。采用16S r RNA高通量测序技术对细菌群落进行分析,发现对照组和A组的α多样性在第1 d和第7d有显著性差异(P<0.05)。在1 d、3 d和7 d,门、纲分类水平上的细菌群落结构多样性较高,且随着剂量增加而发生了明显的变化。添加芽孢杆菌后,可有效改善水质,但随添加剂量的增加,也增强了对罗非鱼养殖水体的多样性和结构组成的改变。3.在综合养殖系统中持续使用复合芽孢杆菌,发现添加芽孢杆菌的YS组中水体氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐和总磷水平下降。实验组YS和对照组YD主要菌门为放线菌门、变形菌门、拟杆菌门和髌骨细菌门。在YS组中放线菌门所占比例更大。在科水平上,YS标志微生物为微杆菌科、微球菌科、放线菌和鞘脂杆菌科,而对照组YD的孢鱼菌科、林杆菌科、沉积物杆状菌、变形菌、硝化螺旋菌科和多核杆菌数量较多。通过排水综合毒性测试,将水产养殖尾水与河流自然水体混合,产生浓度为0%、0.1%、1%和10%稀释梯度,命名为HSK、HS3、HS2和HS1。通过PCo A分析,发现随含芽孢杆菌的尾水排放浓度增大,处理组与对照样本间菌群差异越大。基于物种组成分析,各河流样本中的主要优势门为变形杆菌、放线菌门、拟杆菌门和疣微菌门,HS1组的主要菌门的丰度与对照组HSK有显著差异(P<0.05)。LEf Se分析发现含芽孢杆菌的养殖污水输入导致细菌群落组成的特定变化。在属水平,与HSD相比,HS1和HS2具有更多的特有类群。基于KEGG对水体细菌群落功能的研究,含芽孢杆菌养殖废水会降低水体微生物群落的功能多样性,抑制了参与碳固定和氮代谢的功能基因丰度。
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