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流行性感冒(简称流感)是由流感病毒(influenza virus)引起的急性呼吸道传染病。流感病毒是世界上研究最早的病毒之一,是能在短时间内引起世界大流行的病毒,而且可以在各个年龄段的人群中引起发病。在20世纪,人类发生了四次全球性的大流行。目前的流感疫苗均以鸡胚为基质生产,国内外使用鸡胚培养疫苗已经有50年历史。但鸡胚流感疫苗不易规模化,一旦发生流感大流行,难以在短期内提供足量疫苗。Vero细胞是WHO积极推荐用于疫苗生产的细胞基质。然而流感病毒要在Vero细胞上生长,必须添加胰酶才能保证有效繁殖,而培养液中的牛血清会使胰酶活性丧失,这就要求Vero细胞最好在低血清甚至无血清条件下进行培养。本研究首先以不同低血清浓度培养Vero细胞,并在此基础上接种流感病毒株,优化接种条件。然后对Vero细胞进行无血清培养,并用100ml搅拌瓶进行微载体培养并接种流感病毒H3N2型Vero细胞适应株。一、低血清培养Vero细胞和流感病毒的研究本实验采用SLM-199为基础培养基,添加不同浓度的血清培养Vero细胞,观察细胞连续传代的生长状态,在1.0%血清浓度下培养的Vero细胞接种流感病毒血凝效价较高;固定血清浓度后优化接种流感病毒条件,采用不同pH值、不同TPCK-胰酶浓度和不同接种病毒量,测定其在不同病毒培养条件下的血凝效价,得到最佳培养流感病毒条件为pH值在7.2～7.5之间、TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml、MOI为1.0、病毒繁殖时间72h。二、无血清培养Vero细胞和流感病毒的研究采用逐步降血清法将Vero细胞适应到以DMEM/F12为基础的无血清培养基中。首先静止培养并接种流感病毒,收获病毒量高于有血清培养的Vero细胞。然后采用动态培养Vero细胞并接种流感病毒,初步摸索适宜的培养条件。