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溴隐亭是治疗垂体泌乳素瘤最常用的多巴胺激动剂（DA）,可有效减少垂体泌乳素瘤的肿瘤大小,但其机理尚未完全明了。细胞凋亡已被广泛认为参与溴隐亭引起的肿瘤体积缩小机制。然而,是否还有其他非凋亡性细胞死亡参与溴隐亭缩小肿瘤体积的机制尚不清楚。新近发现的程序性坏死（necroptosis）的分子机制研究,为检查溴隐亭药理学功能中是否可诱导肿瘤细胞坏死提供了可能。本研究的目的是观察和研究程序性坏死在溴隐亭诱导的垂体泌乳素瘤瘤体缩小中的潜在机制。通过免疫组织化学研究,我们发现在溴隐亭治疗后垂体泌乳素瘤患者的瘤体组织中,受体相互作用的丝氨酸-苏氨酸激酶3（RIP3）和磷酸化的混合谱系激酶域样蛋白（p MLKL）阳性细胞数量增加,阳性信号的表达强度也增加。为进一步探讨溴隐亭的作用机制,我们采用泌乳素瘤细胞系（MMQ细胞）研究了体外程序性坏死的机制研究。结果显示,溴隐亭处理后,MMQ细胞的细胞活性和ATP水平降低,而活性氧（ROS）水平升高。坏死抑制剂（necrostatin-1）,可以部分逆转上述作用。超微结构研究进一步证实溴隐亭可诱导MMQ细胞发生程序性坏死,其特征是细胞膜破裂,细胞质溶解,尤其是线粒体肿胀。此外,我们的进一步研究结果表明,磷酸甘油酸突变酶家族5（PGAM5）/亲环素D（CypD）通路参与溴隐亭诱导的RIP3/MLKL依赖性的泌乳素瘤细胞程序性坏死。以上结果提示,细胞程序性坏死可能成为泌乳素瘤临床治疗的新靶标。本研究由以下四个部分组成:第一部分:溴隐亭可诱导人垂体泌乳素瘤组织中RIP3和p MLKL的表达随机选取12例人垂体泌乳素瘤患者瘤体组织纳入本研究。其中,有6个样本来自手术前接受溴隐亭治疗的患者,其他6个样本来自未经溴隐亭治疗的患者。结果显示,溴隐亭治疗后催乳素（PRL）水平降低、肿瘤缩小,这与以前的研究一致。我们进一步研究了细胞程序性坏死是否参与溴隐亭缩小瘤体的机制。免疫组化染色结果显示,程序性坏死相关蛋白RIP3的阳性染色信号可定位在泌乳素瘤细胞的胞质和胞膜。定量分析结果表明,与未使用溴隐亭治疗的患者相比,使用溴隐亭治疗的患者泌乳素瘤瘤体组织汇中RIP3阳性细胞数量及其免疫荧光强度（IFI）显着增加。同时,程序性坏死的另一种关键介质p MLKL也可定位于细胞膜上,统计结果显示溴隐亭治疗后泌乳素瘤组织中p MLKL的表达显着增加。以上结果表明,溴隐亭可诱导垂体泌乳素瘤瘤体组织中程序性坏死关键蛋白RIP3和p MLKL的表达,提示溴隐亭可能诱导泌乳素瘤细胞发生程序性坏死。第二部分:溴隐亭可抑制大鼠垂体泌乳素瘤细胞（MMQ）活性并诱导程序性坏死相关指标本部分实验,我们首先采用CCK-8测定溴隐亭处理后泌乳素瘤MMQ细胞的活性。以0μM至100μM的不同剂量溴隐亭处理MMQ细胞,我们发现溴隐亭以剂量依赖性方式抑制MMQ细胞的活性,而100μM是产生最大效应的剂量浓度。另外,我们研究了溴隐亭对MMQ细胞活性的抑制是否具有时间依赖性。结果显示,24小时和48小时处理,MMQ细胞活性间没有显著性差异。因此,后续试验采用100μM溴隐亭处理24小时的条件。然而,细胞活性降低可能是由不同形式的细胞死亡引起的。鉴于前面的结果,我们检查了细胞程序性坏死的两个指标ROS和ATP的水平,以观察程序性坏死是否参与了MMQ细胞活性降低。结果显示,MMQ细胞的ROS水平提高了1.8倍而ATP水平降低了2.1倍,而Necrostatin-1可以显着抑制这种作用。此外,免疫细胞化学染色结果表明,溴隐亭治疗后,MMQ细胞中RIP3和p MLKL的荧光强度及阳性细胞数显着增加,而Necrostatin-1可部分抑制该作用。结果表明,溴隐亭可以诱导MMQ细胞的RIP3/MLKL依赖性坏死。为进一步研究溴隐亭的作用是否通过RIP3/MLKL信号介导,我们设计了针对RIP3和MLKL的si RNA沉默序列。结果表明,下调RIP3和MLKL可显著逆转溴隐亭诱导的MMQ细胞中细胞程序性坏死相关生化指标ROS和ATP水平变化。以上数据表明,溴隐亭诱导的MMQ细胞程序性坏死至少部分依赖于RIP3/MLKL信号。第三部分:超微结构研究证实溴隐亭确可诱导MMQ细胞发生程序性坏死为进一步证实溴隐亭处理可诱导MMQ细胞发生程序性坏死,我们采用电子显微镜技术研究了MMQ细胞的超微结构变化。结果显示,用溴隐亭处理的MMQ细胞中,发生坏死的细胞数量显著增加,其超微结构特点表现为典型的细胞坏死样改变,如细胞内水肿、细胞质溶解及细胞膜破裂。另外,与对照组相比,溴隐亭处理后的MMQ细胞中出现了大量肿胀线粒体,以上作用可部分被程序性坏死抑制剂Necrostatin-1所抑制。以上研究分别从细胞内生化改变、坏死相关蛋白表达检测及电子显微镜超微结构研究证实了溴隐亭处理可诱导泌乳素瘤细胞发生程序性坏死。第四部分:PGAM5-CypD通路参与溴隐亭诱导泌乳素瘤细胞程序性坏死上一部分的电镜研究显示,坏死MMQ细胞的形态特征不仅表现为细胞膜破裂、细胞质溶解,还存在大量线粒体明显受损、肿胀,提示溴隐亭诱导的MMQ细胞坏死可能与线粒体功能障碍有关。考虑到在病理条件下,RIP3的两个下游信号分子PGAM5和CypD可参与线粒体的肿胀和破裂,我们进一步检测了PGAM5-CypD通路是否参与溴隐亭诱导的MMQ细胞的程序性坏死。Western blot结果显示,Necrostatin-1能显著降低溴隐亭诱导的MMQ细胞中PGAM5和CypD表达,与RIP3和p MLKL的变化一致。此外,溴隐亭对总MLKL和CypD的表达水平没有影响。为进一步探讨PGAM5-CypD通路在溴隐亭诱导的RIP3/p MLKL依赖的程序性坏死中的作用,我们采用免疫共沉淀技术,在溴隐亭诱导的MMQ细胞中验证了p-CypD和RIP3之间存在蛋白质-蛋白质相互作用。进一步采用PGAM5和CypD的si RNA进行干预研究,结果发现,下调PGAM5和CypD可显著抑制溴隐亭诱导的MMQ细胞程序性坏死。以上数据表明,PGAM5-CypD信号参与溴隐亭诱导的MMQ细胞程序性坏死