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第一部分 大鼠脑出血后神经元中GATA结合蛋白-4(GATA-4)的表达变化目的探讨大鼠脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)后神经元内GATA-4的表达变化。方法1、实验动物分组:健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠42只,随机分为Sham(假手术)组和实验组:ICH后6小时、12小时、24小时、148小时、72小时及7天组,一共7组,每组6只大鼠。2、ICH组模型建立:将大鼠麻醉成功后,抽取大鼠自体动脉血,注入右侧基底节区,模拟自发性脑出血。按照实验分组预定时间,在ICH建模后6小时、12小时、24小时、48小时、72小时及7天对大鼠实施安乐死,灌注取脑。3、体外ICH模型建立及分组:分离大鼠胚胎的大脑皮层,收集并培养神经元。将培养的神经元分为6组:control组,3小时组,6小时组,12小时组,18小时组,24小时组。在实验组加入氧合血红蛋白(OxyHb)处理建立ICH体外模型。按照实验分组预定的时间收集神经元。4、应用聚合酶链式反应技术(PCR技术)检测大鼠脑组织中GATA-4mRNA水平在ICH后不同时间点的表达趋势。应用蛋白印迹(Western-blot)法检测大鼠脑组织及神经元中GATA-4蛋白水平在ICH后不同时间点的变化。用免疫荧光染色分析大鼠ICH后神经元中GATA-4的表达水平变化。结果1、大鼠ICH发生后,脑组织内GATA-4 mRNA水平升高,ICH后24小时在脑组织中的表达达到高峰(P<0.01),随后开始下降,但在ICH后72小时,GATA-4 mRNA水平接近假手术组。2、通过蛋白质印迹检测显示ICH后24小时,与假手术组相比,GATA-4蛋白在大鼠脑内的表达达到高峰。在体外神经元中,GATA-4蛋白在OxyHb后6小时达到高峰。3、脑组织及细胞免疫荧光染色进一步证实GATA-4蛋白在神经元中表达,并在ICH后表达增加。结论GATA-4在神经元中表达,并在ICH后24小时达到高峰。提示GATA-4可能参与到ICH后神经元损伤的发生发展中。第二部分 GATA-4蛋白变化对大鼠ICH后神经元的影响目的探讨大鼠ICH后GATA-4蛋白对神经元的影响,以期通过调控GATA-4蛋白的表达缓解ICH后神经元的凋亡。方法1.实验动物分组:健康成年雄性SD大鼠126只,被随机分成7组(每组18只大鼠):假手术组,ICH组,ICH+阴性对照(NC)组,ICH+GATA-4 siRNA组,ICH+空载体(EV)组,ICH+GATA-4 组,和 ICH+GATA-4(S105A)突变组。ICH后24小时,每组随机选6只大鼠实施安乐死并来自收集ICH损伤侧的大脑半球用于检测;然后每组再随机选6只大鼠实施安乐死后取脑组织送石蜡切片,剩余每组6只大鼠用于早期神经行为学测试评分。2、动物模型制作:大鼠麻醉成功后,抽取自体动脉血并采用右侧基底节区注入法建立ICH模型。ICH+阴性对照(NC)组,ICH+GATA-4 siRNA组,ICH+空载体(EV)组,ICH+GATA-4质粒组,和ICH+GATA-4(S105A)突变组中,先脑室内注射进行干预及对照试剂的转染,转染结束后48小时后再建立ICH模型。3、采用干湿法测定及分析ICH后脑水肿情况;用神经行为学评分表及水迷宫检测大鼠神经行为损害情况;用Fluoro-Jade B(FJB)荧光染色法分析不同组ICH后神经元退变情况;运用TUNEL染色分析大鼠大脑皮层脑细胞的凋亡情况;采用免疫荧光染色了解GATA-4在神经元内的表达变化;用Westem-blot法检测脑组织中GATA-4蛋白的含量变化。结果1、与假手术组相比,ICH后大鼠的脑水肿及神经行为严重受损,在ICH+GATA-4 siRNA组,下调GATA-4蛋白的表达后,脑水肿及神经行为缺陷有显著缓解;而在ICH+GATA-4组,上调GATA-4蛋白的表达,大鼠的脑水肿及神经行为损伤缺陷更明显;在ICH+GATA-4(S105A)突变组,在上调GATA-4蛋白的表达,但阻止其在105位处氨基酸的磷酸化,大鼠的脑水肿及神经行为损伤缺陷也有显著缓解。2、通过TUNEL和FJB染色表明ICH后脑内神经元发生凋亡。在ICH+GATA-4 siRNA组,神经元凋亡有显著缓解。而在ICH+GATA-4质粒组,神经元凋亡明显增加。在ICH+GATA-4(S105A)突变组,神经元凋亡也有显著缓解。3、脑组织免疫荧光显示ICH后神经元内GATA-4的表达增加,在ICH+GATA-4 siRNA 组,表达减少;在 ICH+GATA-4 组及 ICH+GATA-4(S105A)组,GATA-4的表达增加。4、Western-blot检测显示,在ICH+GATA-4 siRNA组,GATA-4蛋白的表达减少,活化的caspase-3及Bax蛋白表达水平降低。在ICH+GATA-4质粒组,GATA-4蛋白的表达显著增加,活化的caspase-3及Bax蛋白表达水平也明显增加。在ICH+GATA-4(S105A)突变组,GATA-4蛋白的表达显著增加,但蛋白磷酸化水平降低,活化的caspase-3及Bax蛋白表达水平降低。结论在体内ICH模型中,通过使用GATA-4蛋白的小干扰siRNA,敲低GATA-4蛋白的表达,可以降低caspase-3蛋白的活化及Bax蛋白的表达水平,减轻神经元凋亡和退化;使用质粒过表达GATA-4蛋白,可以增加caspase-3蛋白的活化及Bax蛋白的表达水平,加重神经元的凋亡和退化;在抑制GATA-4蛋白的105位丝氨酸磷酸化后,可以降低caspase-3蛋白的活化及Bax蛋白的表达水平,减轻神经元凋亡和退化。提示GATA-4蛋白通过其磷酸化调控Bax,从而在ICH后神经元的凋亡中发挥作用。第三部分 GATA-4参与ICH后神经元凋亡的作用及其机制研究目的探讨GATA-4调控ICH后神经元凋亡的通路及其机制。方法1、体外ICH模型:分离培养大鼠胚胎的大脑皮层神经元细胞,在使用siRNA和质粒转染48小时后,利用氧合血红蛋白(OxyHb)处理建立ICH体外模型。然后收集神经元。2、实验分组:首先,将培养的神经元分为6组:对照组,OxyHb,OxyHb+NC,OxyHb+GATA-4 siRNA,OxyHb+EV 和 OxyHb+GATA-4 质粒。接着,将培育的神经元分为5组:对照组,OxyHb组,OxyHb+EV组,OxyHb+GATA-4质粒,OxyHb+GATA-4(S105A)。3、用Western-blot法分析神经元中GATA-4蛋白的变化以及NF-κB/Bax/Caspase-3的表达情况。用细胞流式测试各组神经元凋亡情况。结果1、利用siRNA敲低或利用质粒上调GATA-4蛋白的表达后,神经元内NF-κB、Bax以及活化Caspase-3蛋白表达相应减少或增高。神经元凋亡也相应减少或增加。2、GATA-4蛋白的表达增加,但抑制GATA-4蛋白磷酸化后,神经元内NF-κB、Bax以及活化Caspase-3蛋白表达相应减少,神经元凋亡也有减轻。结论GATA-4通过调控NF-κB/Bax通路诱导ICH后神经元的凋亡。GATA-4对神经元凋亡的影响取决于它105位丝氨酸的磷酸化水平。降低GATA-4蛋白表达或抑制其磷酸化,可以减少神经元的凋亡。