参薯(Dioscorea alata)富含碳水化合物、蛋白质、维生素,是热带以及亚热带地区的重要有机食物来源。参薯产量高的亩产可达上万斤,但是地下块茎形态多变,研究参薯块茎膨大的机制将为培育优良薯型品种奠定理论基础。MicroRNA(miRNA)参与植物体众多的生命活动,包括植物的生长、发育、繁殖和逆境反应,土豆中miR172和miRNA156通过参与光周期途径影响薯类作物的块茎形成,超量表达miR172可以加快块茎在长日照条件下形成,而过量表达miR156会改变土豆形态且块茎产量下降。本实验以测序的参薯基因组、转录谱和小RNA数据为基础,利用生物信息学工具挖掘茎和块茎中差异表达的miRNA,筛选在块茎形成过程中起到关键作用的miRNA,并预测其靶基因,之后通过RT-PCR、RT-qPCR分析miRNA和靶基因的表达特征,并应用荧光双报告系统验证miRNA靶基因,得到了如下的结果:1、通过小RNA序列分析对比,得到参薯中保守miRNA家族的miRNA基因139个,比对分析参薯普通茎和块茎的小RNA数据,获得差异表达两倍以上的miRNA 基因 44 个,其中属于 miR159,miR164,miR167 和 miR168 家族的 miRNA有9个。对miRNA前体序列进行了二级结构的预测,前体序列长度变化较大,在77-212 bp区间内,在预测的成熟miRNA序列中,miR159的不同基因位点只在miRNA长度上有1-2个碱基的差异,成熟miRNA序列5端一致。对靶基因进行预测并对结果进行注释发现4个家族中可能的靶基因一共有1 7个,不同miRNA家族可能对应同一个靶基因,同一个miRNA家族可能对应不同的靶基因。为了进一步分析这4个miRNA家族中的哪些基因有表达,我们依据参薯的转录谱数据找到13个miRNA的前体序列。2、使用RT-PCR检测miR159,miR164,miR167和miR168的在参薯不同组织的表达部位,发现这4个家族中有5个miRNA基因在块茎中都有表达,在叶、茎组织中都有一定的表达量,而其余miRNA均在叶、茎和块茎中表达,没有组织表达的特异性。3、在组培苗的叶、茎、块茎和田间的叶、茎和块茎的4个发育时期共12个组织进行14个差异表达成熟miRNA的表达模式进行RT-qPCR检测,结果发现8个miRNA在块茎中表达量高于其他组织,这些miRNA属于miR164(1个)、miR171(1 个)、miR396(1 个)和 miR168(5 个)家族,而 miR167、miR398、miR156等miRNA在块茎表达量显著低于其他组织,剩余miRNA在田间的茎、叶组织表达差异低,大部分结果符合小RNA的测序。4、使用RT-qPCR检测与miRNA相同的12个参薯组织中,17个靶基因的表达模式,荧光定量PCR检测结果大部分基因在田间块茎不同发育时期的表达量较低,除了DaLSH3-1、DaLSH3-2、DaAlfin的等基因在块茎中表达量显著高于其他组织。DaCO、DaGRAS1、DaTify、DaMYC等基因在叶片表达量显著高于其他组织,而其余基因在茎中的表达量显著高于块茎组织。以上结果表明miR171与靶基因DaGRAS1/DaGRAS2、miR396 与靶基因 miR159 与靶基因 DaMYC 间存在较为明显的消长关系。5、对双荧光报告系统中的连接靶基因序列的载体进行改造,加入35S启动子启动靶序列的表达,并在靶序列插入位点加入多克隆位点序列,为后续实验提供基础,另外将miR156家族的5个基因序列连上双荧光报告系统的psk62载体。