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背景和目的尘肺病的发生发展是粉尘引起多细胞藉由信号传递而相互作用的调控过程,与巨噬细胞诱导的肺组织微环境炎性改变、肺成纤维细胞表型转分化密不可分。以往主要研究活性分子为信号介导的巨噬细胞和肺成纤维细胞间调控效应,但此类分子来源广泛,无法完全解释尘肺病发生机制。外泌体在细胞间信号传递中的作用日益受到重视,而外泌体miRNAs作为细胞间通讯的信号媒介具有良好的标识性、特异性和稳定性,且在以肺组织纤维化为主要病理改变的特发性肺纤维化疾病中也证实了其作用的存在,推测尘肺病过程中很可能存在巨噬细胞外泌体miRNAs介导的肺成纤维细胞信号传递和调控效应。本课题拟从细胞培养提取、鉴定外泌体入手,构建染尘巨噬细胞外泌体刺激肺成纤维细胞模型,结合人群流行病学调查,采用荧光标记、高通量测序、流式细胞术、透射电子显微镜等技术,系统观察巨噬细胞来源外泌体miRNAs的生物学特性及其在尘肺病发生发展中对肺成纤维细胞通讯的参与程度、活性效应、调控路径,阐释其对肺成纤维细胞转分化及肺组织纤维化等过程的影响,扩展对尘肺病发生发展机制的认识,发现尘肺病新型潜在生物标志和靶点,为进一步研制尘肺病监测与早期发现的有效指标及干预措施提供了新的思路和参考依据。材料和方法1.染尘巨噬细胞外泌体提取、鉴定及其对肺成纤维细胞转分化影响观察采用系列浓度SiO2粉尘分别刺激巨噬细胞,观察细胞形态,检测细胞活性,确定染尘浓度。收集细胞培养上清,以试剂盒法、超速离心法等分别提取外泌体,比较不同方法外泌体获取率差异;以透射电子显微镜、纳米追踪分析（Nanosight tracking analysis,NTA）、Western Blot等技术观察并鉴定外泌体。提取BABL/c小鼠原代肺成纤维细胞,以胰酶消化法传至第四代,观察并记录细胞生长状况,检测各代肺成纤维细胞转分化。以红绿荧光探针分别标记肺成纤维细胞和巨噬细胞外泌体,共孵育后观察外泌体分布并检测肺成纤维细胞转分化。2.尘肺相关巨噬细胞外泌体miRNAs筛选和生物信息学功能预测以尘肺病患者54例为病例组,煤工尘作业岗前体检人员100例为对照组,记录基线资料,收集血清,提取外泌体。取人源、鼠源外泌体,提取总RNA,构建miRNAs文库,比对miRNAs序列,筛选差异表达miRNAs,并以≤2碱基误配标准确定保守序列。采用miRanda数据库预测miRNAs靶基因,GO、KEGG数据库对miRNAs及其靶基因进行功能注释,筛选肺成纤维细胞表型转分化相关基因及信号通路。3.miR-107-3p对肺成纤维细胞转分化的作用和机制以SiO2粉尘刺激巨噬细胞,收集细胞培养上清,提取外泌体,透射电子显微镜观察并鉴定外泌体形态。以染尘巨噬细胞外泌体、miR-107-3p mimic/inhibitor分别干预肺成纤维细胞,检测细胞活性,观察并定量α-SMA水平,流式细胞术检测肺成纤维细胞表型转分化,Western Blot检测TGF-β信号通路相关蛋白Chordin、BMP-2、Smad-1、Smad-5、Smad-9、Id-1表达水平。4.统计学分析采用Microsoft Excel 2016软件包汇总数据并构建数据库,SAS 9.4软件包对数据进行统计学处理和分析。计量资料以均数±标准差表示,两组样本间差异的比较采用t检验（正态资料）或秩和检验（非正态）,三组及以上样本间差异的比较采用方差分析,计数资料的比较采用卡方检验,检验水准α=0.05。结果1.染尘巨噬细胞外泌体提取、鉴定及其对肺成纤维细胞转分化影响观察1.1 SiO2粉尘刺激对巨噬细胞活性及形态的影响SiO2染尘后,巨噬细胞聚团成簇生长,形态正常;100μg/ml SiO2染尘组细胞融合度90%,部分细胞肿胀变形甚至崩解。0～80μg/ml组活细胞比例100%、79%、82%、74%,组间差异无统计学意义（P>0.05）,但均较100μg/ml组（62%）高（P<0.05）。因此,该浓度可作为巨噬细胞活性下调临界浓度用于后续研究。1.2外泌体的提取、纯化、鉴定及SiO2染尘对其分泌水平的影响经外泌体表面特异性蛋白检测,试剂盒法、超速离心法及滤过超速离心法均可提取巨噬细胞外泌体;透射电子显微镜图像显示,试剂盒法及超速离心法外泌体形态结构不清,滤过超速离心法可见外泌体脂质双分子层结构。经Nanosight外泌体粒径分析及BCA总蛋白定量,SiO2粉尘刺激前后单细胞外泌体产量分别为1.58×102和8.27×102,呈上升趋势（P<0.05）。1.3原代肺成纤维细胞的提取及传代对其转分化的影响以改良法提取小鼠原代肺成纤维细胞,第一代、第二代细胞形态完好,梭形明显;第三代细胞表面颗粒物增多,细胞间隙均一性差;第四代细胞体积增大、梭形消失。免疫荧光显微镜提示随细胞传代次数增加,细胞α-SMA红染面积扩大;流式细胞术提示P0-P3肺成纤维细胞转分化比例均低于35%,P4代显著提升达80%（P<0.05）,不具备后续研究价值。1.4巨噬细胞外泌体对肺成纤维细胞转分化的影响染尘巨噬细胞外泌体与肺成纤维细胞共孵育后,激光共聚焦显微镜下可见典型的红染肺成纤维细胞梭形轮廓,绿染的外泌体散布于整个视野,点状分布,并于肺成纤维细胞周围聚集,部分外泌体与细胞膜融合,呈现黄色斑点。流式细胞术提示染尘巨噬细胞外泌体干预的肺成纤维细胞转分化比例,较正常巨噬细胞外泌体及PBS对照组高（50.19±3.71 vs.5.90±1.45,50.19±3.71 vs.5.46±1.32,P<0.05）;免疫组化提示不同干预处理的肺成纤维细胞α-SMA、Vinculin和PTEN等蛋白表达水平与流式细胞术趋势一致。2.尘肺相关巨噬细胞外泌体miRNAs筛选和生物信息学功能预测2.1染尘巨噬细胞外泌体差异表达miRNAs筛选经基因测序,小鼠巨噬细胞培养上清外泌体共检测出miRNAs 994种,其中155条miRNAs表达上调,143条miRNAs表达下调。2.2尘肺病患者血清外泌体差异表达miRNAs筛选本研究共纳入尘肺病患者和健康对照154例,其中矽肺25例（壹期17例,贰期6例,叁期2例）、煤工尘肺29例（壹期20例,贰期6例,叁期3例）、健康岗前体检男性100例。经基因测序,人血清外泌体共检测出miRNAs 604种,其中155条miRNAs表达上调,120条miRNAs表达下调。2.3人源、鼠源高保守miRNAs序列比对、靶基因预测及功能注释经比对,小鼠高保守差异表达miRNAs共计14条,对应人miRNAs 12条,其中两者表达趋势一致miRNAs 7条,miR-126a-5p、miR-335-5p、miR-122-5p、miR-125a-5p、miR-30c-2-3p和miR-107-3p高表达,miR-27b-5p低表达。经miRanda数据库注释,小鼠14条差异表达高保守miRNAs对应靶基因数总计1111个,小鼠与人表达趋势一致的7条miRNAs对应靶基因数总计760个。GO、KEGG数据库功能注释显示,此类miRNAs参与生物学过程功能项187个、分子功能项39个、构成细胞组分38个,涵盖细胞分化、心血管系统发育、酶结合、神经系统发育等生物学过程。选取TGF-β信号通路探索肺成纤维细胞表型转分化机制,该信号通路对应靶基因分别为Chordin,Inhbe,Rock1,Smurf1,Sp1和Tgif2,参与调控其表达的miRNAs为miR-107-3p、miR-125a-5p、miR-30c-2-3p和miR-335-5p。3.miR-107-3p对肺成纤维细胞转分化的作用和机制3.1 miR-107-3p对肺成纤维细胞表型转分化作用观察以miR-107-3p mimic/inhibitor、染尘巨噬细胞外泌体分别干预肺成纤维细胞,mimic组与外泌体组细胞体积增大、部分细胞梭形消失;inhibitor组细胞形态规则,数量增多,与正常对照组相似。细胞活性检测结果显示inhibitor组较正常对照组高（176.13±59.58 vs.97.88±8.08,P<0.05）,外泌体组和mimic组细胞活性均较对照组及inhibitor组低（P<0.05）,但前两组间差异无统计学意义（41.66±0.80 vs.38.45±4.12,P>0.05）。免疫荧光显微镜下可见inhibitor组肺成纤维细胞多以蓝染细胞核为主,而mimic组、外泌体组细胞细胞质红染;免疫组织化学显示mimic组及外泌体组高表达α-SMA,inhibitor组α-SMA表达水平与PBS对照组相似,差异无统计学意义（P>0.05）。3.2 miR-107-3p调控的TGF-β信号通路相关蛋白表达水平检测Chordin表达水平于inhibitor组最高,外泌体组及mimic组较PBS对照组下降（P<0.05）;Chordin下游基因BMP-2、Smad-1/5/9和Id检测结果显示,inhibitor组与对照组表达水平稍低,采用染尘巨噬细胞外泌体或mimic干预后其表达水平上调（P<0.05）。结论SiO2粉尘刺激能致巨噬细胞分泌外泌体数量增多且内含miRNAs谱发生改变,仅用提纯的外泌体即可诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化。此调控作用可能与诱导的外泌体向肺成纤维细胞传递miR-107-3p,靶向抑制Chordin基因及其下游基因BMP-2、Smad-1/5/9、Id-1表达,进而激活TGF-β信号通路有关。