【摘 要】
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伏马毒素（Fumonisin,FB）是目前农作物产品和动物饲料中广泛存在的主要真菌毒素之一,对养殖业的规模化发展、动物食品安全与人类健康造成了极大的威胁。伏马毒素B1是伏马毒素中毒性最强的一种,与人和动物的多种疾病相关,如猪肺水肿、马脑白质软化症、人神经管型缺陷等,但其作用机制尚不清楚。本研究以体外培养猪脐静脉血管内皮细胞（SUVEC）为研究对象,探索FB1对SUVEC细胞自噬及其相关通路的影响,
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伏马毒素（Fumonisin,FB）是目前农作物产品和动物饲料中广泛存在的主要真菌毒素之一,对养殖业的规模化发展、动物食品安全与人类健康造成了极大的威胁。伏马毒素B1是伏马毒素中毒性最强的一种,与人和动物的多种疾病相关,如猪肺水肿、马脑白质软化症、人神经管型缺陷等,但其作用机制尚不清楚。本研究以体外培养猪脐静脉血管内皮细胞（SUVEC）为研究对象,探索FB1对SUVEC细胞自噬及其相关通路的影响,为FB1致猪肺水肿的毒性作用机制提供理论基础。本研究通过体外培养SUVEC细胞,研究不同浓度的FB1对细胞自噬的影响。采用MTT法检测了不同浓度FB1作用不同时间对细胞存活率的影响,划痕实验观察细胞迁移能力,透射电镜观察细胞内自噬小体的产生,q PCR和Western Blot技术检测细胞自噬及PI3K/AKT/mTOR和AMPK/mTOR通路中相关基因和蛋白的表达变化,构建p EGFP-N1-FLAG-LC3质粒并转染细胞检测LC3的聚集数量和位置变化。通过加入自噬诱导剂雷帕霉素（RAPA）和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）,探讨细胞自噬与相关通路的关系及其在FB1致SUVEC细胞损伤中的作用。研究结果显示,40μg/m L FB1作用24 h后显著降低了SUVEC细胞存活率,20μg/m L的FB1作用48 h时显著降低细胞存活率,而不同浓度FB1作用72 h后均显著抑制细胞存活率;划痕处理后FB1作用24 h和48 h,观察细胞在24 h时向划痕中心迁移能力较强,在48 h时已呈零星散乱分布;透射电镜观察发现FB1处理组中出现双层膜结构的自噬小体;构建p EGFP-N1-FLAG-LC3质粒并转染细胞,在荧光显微镜下观察发现与对照组相比,LC3的荧光亮度逐渐聚集增强,并从细胞质逐渐向自噬体膜移动;q PCR和WB结果显示自噬相关基因ATG5和Beclin 1的表达上升,LC3II/LC3I比值上调,而P62的表达水平下降。以上结果表明一定浓度的FB1可以影响SUVEC细胞存活和迁移能力,诱导细胞自噬。对FB1作用后自噬相关通路的研究发现,PI3K、AKT和mTOR的m RNA和蛋白表达水平均下降,PI3K/AKT/mTOR信号通路被抑制;而AMPK的表达升高,抑制了mTOR的表达,AMPK/mTOR信号通路被激活。采用自噬诱导剂RAPA预处理3 h后,与单独FB1处理组相比,细胞存活率显著上升,mTOR和P62表达显著降低,LC3II/LC3I水平上升;用自噬抑制剂3-MA预处理6 h后,与单独FB1处理组相比,抑制剂预处理组的细胞存活率显著下降,PI3K和LC3II/LC3I表达水平下降,P62表达上升。以上结果表明FB1可能通过PI3K/AKT/mTOR和AMPK/mTOR信号通路来诱导细胞自噬发生,而细胞自噬可能在FB1致SUVEC细胞损伤中起保护作用。
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