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随着科技的不断发展,人们对于DNA的认知不仅仅局限于其作为遗传信息的携带者,而是将其看做是一种完美的“建筑材料”,并以此为出发点提出了“结构”和“动态”DNA纳米技术。结构DNA纳米技术利用特异性碱基互补配对作用来构建不同的DNA纳米结构,如由数百条链构成的相对复杂的DNA折纸和由几条链自组装而成的相对简单的DNA四面体。这些DNA结构有着单链DNA（Single-strand DNA,ss DNA）无可比拟的优点,比如在复杂环境中的稳定性好、易于进入细胞等。动态DNA纳米技术以立足点介导的链置换反应（Toehold-mediated strand displacement reaction,TMSDR）为基础发展出了不同的核酸信号放大技术,如熵驱动的DNA线路（Entropy-driven DNA circuit,EDC）和杂交链反应（Hybridization chain reaction,HCR）等,这些信号放大技术及它们之间的级联体系在疾病标志物（如微小核糖核酸micro RNA）的生物传感和成像中有着广泛的应用。但现有研究中,对各类核酸信号放大技术及它们之间级联体系的利用仅限于其强大的信号放大能力,而对其具有的严格逻辑关系在核酸智能传感中的应用还有待进一步研究。DNA生物计算体系可以在同时处理不同的输入信号之后给出一个准确的输出信号,这一特点使其在核酸智能传感和疾病的精准诊断中也有着巨大的应用前景。因而,利用各类核酸信号放大技术所具有的严格逻辑关系来构建以疾病标志物为输入信号的核酸智能传感体系,不仅能够扩展核酸信号放大技术的应用范围,还能为疾病的精准诊断提供有效的手段。此外,当DNA生物计算体系中的各种DNA计算元件处于游离状态时还存在以下问题:（1）DNA计算速率和效率较低;（2）各种DNA计算元件难以进入癌细胞;（3）即使通过载体将各种DNA计算元件转运至癌细胞内,游离的DNA也容易被细胞内的各种酶降解,难以执行逻辑计算功能。因而将各种DNA计算元件集成到在复杂环境中稳定好、且易进入癌细胞的DNA纳米结构上对构建高效的DNA生物计算体系尤为重要。基于以上讨论,本论文致力于1)建立核酸信号放大技术、DNA生物计算和核酸智能传感之间的关系,2)构建以核酸类疾病标志物为输入信号的高度集成的DNA生物计算体系,扩展DNA生物计算在疾病精准诊断中的应用。具体工作如下:1.AND逻辑原则指导构建熵驱动DNA线路参与的级联体系用于信息传递由不同DNA线路组成的级联核酸信号放大体系在微量核酸类疾病标志物的灵敏传感中有着广泛的应用,但是系统泄漏是限制其发展的关键问题。在构建以EDC为上游线路的级联核酸信号放大体系中,由等摩尔比（1:1:1）的三条ss DNA组成的三元反应物对于上游EDC与下游线路的成功串联是必不可少的。如果该比例失衡,则会导致系统泄漏。为此,本工作以级联AND逻辑门的原理为指导原则,针对上游EDC衍生的下游线路的潜在引发链,提出了“拆分-重构”和“保护-释放”策略,以避免EDC参与的级联体系构建中的系统泄漏。基于这两种策略,本工作成功构建了两种级联DNA体系,分别命名为EDC2-4WJ-TMSDR和EDC3-HCR。在这两种级联体系中,下游线路引发链的“重构”或者“释放”都遵循级联AND逻辑门的原理。实验结果证明,上述不同ss DNA之间的比例不用严格保持为1:1:1也能保证级联DNA体系按照设计的顺序进行。此外,上游EDC的内在特征也能传递到下游DNA线路中,使得所构建的两种级联DNA体系具有更强大的信号放大能力,从而实现了不同micro RNA的DNA类似物的智能灵敏传感。本工作不仅在微量核酸类疾病标志物的智能灵敏传感中有很大的应用前景,同时也为构建EDC样DNA线路参与的高阶核酸智能传感器提供了新思路。2.层级杂交链反应体系的构建及其在核酸信号放大和级联DNA逻辑线路中的应用在第1部分工作中,上游线路EDC的反应物是由三种不同的ss DNA杂交而成的,对这三种ss DNA比例的严格要求极大地限制了EDC参与的级联核酸信号放大体系的发展,而以DNA发卡为反应物的不同线路在构建级联体系时则不存在这一问题。但是,大部分研究仅利用了不同级联体系的信号放大功能,而对于级联体系中不同线路之间严格逻辑关系的利用及其应用还有待探索。为此,本工作提出了一种由第一层级HCR(First layer HCR,1stHCR)、第二层级HCR(Second-layer HCR,2ndHCR)和第三层级HCR(Third-layer HCR,3rdHCR)组成的层级杂交链反应（Three-layer hierarchical hybridization chain reaction,3L h HCR）体系。采取了“拆分-重构”策略来避免3L h HCR体系产生高的背景信号,即下游HCR的引发链首先被拆分成独立的两部分,当上游HCR被激活时会使得预先拆分的下游HCR引发链的两部分形成重构引发链。3L h HCR体系在第一层级引发链(First layer initiator,1stI)的激活下会产生明显的荧光信号恢复,因此,可以在50 pmol/L到10 nmol/L范围内实现对1stI的超灵敏检测。此外,当1stI的浓度低于1 nmol/L时,3L h HCR在区分不同浓度1stI时具有优于传统2L h HCRⅠ体系的能力。利用3L h HCR中不同线路之间严格的分层自组装路径可实现对输入信号具有高特异性的级联AND（Cascade AND,C-AND）逻辑门和具有快速错误报告功能的分子键盘锁的操作。进一步地,通过设计不同的辅助性DNA,并利用三种不同micro RNA的DNA类似物来打开分子键盘锁,证明了基于3L h HCR的分子键盘锁可用于癌症的精准诊断。本工作不仅为构建多层级联核酸信号放大体系提供了新思路、拓宽了级联体系的应用范围,而且还为疾病的精准诊断提供了有效的手段。3.模块化设计的可逆DNA计算平台的构建及其在高效核酸智能传感中的应用第2部分工作虽然利用级联核酸信号放大体系实现了DNA逻辑线路的操作,但是输入信号和信号报告单元的序列之间存在相互干扰,限制了DNA生物计算体系中输入信号序列设计的灵活性和可扩展性。此外,对弱输入信号的灵敏感知在开发新型DNA计算体系时至关重要。为此,在“弱输入-强输出”策略的指导下,本工作将模块化设计的可逆DNA计算平台与核酸信号放大技术HCR结合起来,构建了可以将弱输入信号转化为强输出信号的灵敏逻辑纳米器件。由于输入信号和信号报告单元HCR序列之间不会相互干扰,故可以很容易实现YES,INHIBIT,OR,NAND,NOR,INHIBIT-OR等不同灵敏逻辑纳米器件和数字分类器的操作。实验结果表明,以HCR作为信号放大器的灵敏逻辑纳米器件可以提高逻辑体系对输入信号的灵敏度。并且在微量输入信号的作用下,信号放大器HCR可以在短时间内产生大量的输出信号,而这些输出信号具有作为其它DNA计算体系的输入信号的潜力,信号放大器HCR的使用也提高了DNA计算体系的计算速率和效率。故而本工作所设计的可逆DNA计算平台在高效通用的核酸智能传感体系的构建上具有指导意义。4.高度集成的DNA生物计算平台的构建及其在活细胞内micro RNA智能传感中的应用前面几部分工作在溶液水平上研究了不同的核酸智能传感体系,而这在疾病精准诊断中仍有所欠缺。为此,本工作通过将两种不同的计算元件负载于同一个DNA四面体上,开发了一种配备核酸适配体的高度集成的DNA生物计算平台（Aptamer-equipped high-integrated DNA biocomputing platform,HIDBP-A）。HIDBP-A可以利用micro RNA 21和micro RNA 155作为输入信号在癌细胞内执行AND逻辑运算。核酸适配体作为靶向单元,可以提高HIDBP-A进入癌细胞的能力。当HIDBP-A在癌细胞内与过表达的输入信号相互作用后,两种计算元件会发生构象转变,从而暴露出可以使它们相互杂交的互补单链粘性末端。两种计算元件杂交的过程可以拉近Cy3和Cy5之间的距离,从而产生显著的荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）信号,该显著FRET信号被定义为output 1。与游离DNA生物计算平台（Free DNA biocomputing platform,FDBP）相比,将所有计算元件集成到同一个DNA四面体上可以提高计算元件的局部浓度,从而极大地提高了计算速度和效率。当癌细胞中一种或者两种输入信号的表达量降低时,HIDBP-A则会输出弱的FRET信号。利用micro RNA作为输入信号有利于提高DNA生物计算体系序列设计的可扩展性和灵活性,此外,由于在某些癌细胞中过表达多种不同的micro RNA,因此,HIDBP-A在疾病的精确诊断方面有很大的价值。综上所述,本论文构建了不同的可用于核酸智能传感的DNA生物计算体系,并在此基础上实现了癌细胞中的逻辑运算。首先利用级联AND逻辑原则指导构建级联核酸信号放大体系,接着利用级联核酸信号放大系统中的逻辑关系来构建核酸智能传感体系,进一步通过对DNA计算平台的模块化设计和信号放大器的引入来构建高效通用的DNA计算体系,最后通过利用核酸类疾病标志物为输入信号构建了可用于疾病精准诊断的高度集成的DNA生物计算平台。