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脓毒症所致急性肝功能衰竭是一种发病率低(≤1/10万),但致死率极高的危重病。其主要病理生理为肝糖异生减少、凝血因子合成减少、血乳酸代谢能力降低、血氨清除减少、骨髓造血抑制、肾血管收缩及机体高分解代谢状态。病人表现为易出血、乳酸酸中毒、肝性脑病、脑水肿、易感染、肝肾综合症,这将加速脓毒症的病情进展。目前治疗多以对症支持、保肝为主,缺乏有效的治疗方法,其发病机理还不明确。鞘氨醇激酶1 (SphK1)是一种胞内脂质酶,调控细胞脂质代谢生成磷酸鞘氨醇(S1P),胞内S1P可直接参与细胞信号转导。胞内S1P也可通过细胞膜上转运体转运至细胞外,与其自身受体结合间接激活胞内信号转导。多项研究表明,SphK1-S1P-磷酸鞘氨醇受体(S1PRs)信号通路参与调控细胞增殖、死亡、迁移、炎症反应等生命活动,但其在脓毒症所致急性肝衰竭中的作用还不明确。在脓毒症所致急性肝衰竭的发病机制中,肿瘤坏死因子α(TNF-α)被认为是一种关键炎症介质,它可激活胞内半胱天冬酶(caspase)诱导细胞发生凋亡,激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)诱导细胞表达多种炎症因子。MAPK家族蛋白包括应激活化蛋白激酶(JNK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)和p38,可参与调控细胞应激、炎症反应、细胞分化、细胞增殖凋亡等生命活动。目前研究认为,MAPK家族蛋白在脓毒症所致急性肝衰竭的发病机制中起重要作用,但SphK1信号通路在脓毒症所致急性肝衰竭中的作用是否与MAPK家族蛋白相关还不明确。本研究试图通过动物实验,探究SphK1信号通路是否参与脓毒症所致急性肝衰竭的发病；抑制SphK1信号通路后对脓毒症所致肝损害的影响；抑制SphK1后脓毒症所致急性肝衰竭改善的可能机制,旨在为脓毒症所致急性肝衰竭的研究提供可能治疗靶点。第一部分鞘氨醇激酶1(SphK1)在脓毒症所致急性肝衰竭中的作用目的 探究鞘氨醇激酶1(SphK1)信号通路是否参与脓毒症所致急性肝衰竭的疾病过程。方法 本实验采用C57BL小鼠,雄性,6-8周。脓毒症所致急性肝衰竭动物模型采用目前国际公认的造模方法：腹腔注射内毒素(LPS) 50μg/kg+D-半乳糖胺(GalN)1g/kg。腹腔注射SphK1化学特异性抑制剂SKI-5c,2mg/kg,以抑制SphK1的表达；腹腔注射S1PR1化学特异性抑制剂W146,0.1 mg/kg,以抑制S1PR1的表达；腹腔注射S1PR3化学特异性抑制剂CAY10444,0.1 mg/kg,以抑制S1PR3的表达。实验小鼠随机分成五组：对照组(n=20只)；肝衰竭组(LPS/GalN, n=20只);SphK1抑制组(LPS/GalN+SKI-5c, n=20只);S1PR1抑制组(LPS/GalN+W146, n=20只)；S1PR3抑制组((LPS/GalN+CAY 10444, n=20只)。造模2h后,每组随机处死10只小鼠,取血,用于检测血清炎症因子水平；造模6h后取血,用于检测血清转氨酶水平；造模6h后取肝脏用于检测SphKK S1PR1.3的表达、肝病理、肝半胱天冬酶3(caspase-3)活性、肝髓过氧化物酶(MPO)活性。结果 与对照组相比,脓毒症所致急性肝衰竭小鼠肝脏SphK1、S1PR1、S1PR3的蛋白水平上调(P<0.01)；与肝衰竭组小鼠相比,抑制SphK1组肝组织出血情况好转(P<0.001),血清谷草转氨酶(AST)水平降低(P<0.01),血清谷丙转氨酶(ALT)水平下调(P<0.001),血清TNF-α水平降低(P<0.001),血清IL-6浓度降低(P<0.01),肝组织caspase-3酶活性下调(P<0.01),肝组织MPO活性被抑制(P=0.051)。抑制S1PR1或S1PR3后,对脓毒症所致肝损害无明显影响。结论 脓毒症所致急性肝衰竭时SphK1-S1PR1,3通路被激活；抑制SphK1后可缓解脓毒症所致肝组织出血、血清转氨酶水平、血清炎症因子水平(TNF-α、IL-6)、肝组织caspase-3和MPO酶活性。第二部分抑制鞘氨醇激酶1(SphK1)后脓毒症所致急性肝衰竭改善的可能机制目的 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族蛋白包括应激活化蛋白激酶(JNK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)和p38,在脓毒症所致急性肝衰竭发生发展中起重要作用。本部分实验旨在探究抑制SphK1后是否通过阻断MAPK通路来改善脓毒症所致肝损害。方法 实验采用C57BL小鼠,雄性,6-8周,动物造模方法见实验第一部分,随机分成五组,对照组(n=10只)；肝衰竭组(LPS/GalN, n=10只)；SphK1抑制组(LPS/GalN+SKI-5c,n=10只);S1PR1抑制组(LPS/Ga1N+W146,n=10只);S1PR3抑制组((LPS/GalN+CAY10444, n=10只)。造模6h后取肝脏,用免疫印迹法(western blotting)检测各组MAPK家族蛋白的表达情况结果 实验发现,与对照组相比,脓毒症所致急性肝衰竭时肝脏JNK、ERK、p38蛋白表达上调(P<0.05)；与肝衰竭组相比,抑制SphK1后可抑制JNK、 ERK、p38蛋白表达(P<0.05)；抑制S1PR1,3后可部分抑制JNK、ERK、p38的表达。结论 脓毒症所致急性肝衰竭时,抑制SphK1可通过阻断MAPK通路的激活来缓解肝脏出血、血清转氨酶水平、血清TNF-α及IL-6浓度、肝组织caspase-3和MPO酶活性。