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中医从整体观念出发,认为痰阻清窍、元气虚馁是阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)的主要病机,治疗当用补气开窍法。开窍药石菖蒲的挥发油成分具有神经药理作用,补气药人参的人参总皂苷能改善AD症状,推测石菖蒲挥发油与人参总皂昔配伍后治疗AD的作用更强。自噬与淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的代谢、β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ)的生成密切相关,推测两药配伍后可能通过干预自噬发挥防治AD作用。本实验主要由4个部分组成,第一部分:石菖蒲挥发油联合人参总皂苷对D-半乳糖联合氯化铝致AD模型小鼠学习记忆能力的影响,探讨联合用药对D-半乳糖联合氯化铝致AD模型小鼠的干预作用;第二部分:石菖蒲挥发油联合人参总皂苷对APP/早老素1(Presenilin 1,PS1)双转基因AD模型小鼠的学习记忆能力及乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh)代谢的影响,探讨联合用药对APP/PS1双转基因AD模型小鼠的药理作用;第三部分:石菖蒲挥发油联合人参总皂苷对APP/PS1双转基因AD模型小鼠的自噬相关因子Beclin-1,LC3B,p62和Bcl-2影响,探讨联合用药对APP/PS1双转基因AD模型小鼠中自噬的影响;第四部分:石菖蒲挥发油联合人参总皂苷对APP/PS1双转基因AD模型小鼠的磷酸肌醇3激酶(Phosphotylinosital 3 kinase,PI3K)/丝-苏氨酸激酶(serine-threonine kinase,Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin,mTOR)/Beclin-1 通路影响,探讨联合用药对APP/PS1双转基因AD模型小鼠的作用机制。第一部分实验目的:研究石菖蒲挥发油联合人参总皂苷对D-半乳糖联合氯化铝致AD模型小鼠的学习记忆能力的影响。方法:将50只昆明小鼠随机分为正常对照组、模型组、安理申组(1mg/kg)、定志丸组(10 g/kg)和联合用药组(石菖蒲挥发油30 mg/kg +人参总皂苷150 mg/kg)。除正常对照组外,各组小鼠通过腹腔注射D-半乳糖(150 mg/kg)和灌胃氯化铝(5 mg/kg)制备AD模型,连续40天,1次/天。在造模第20天开始各组小鼠同时给予相应药物治疗,连续给药40天,1次/天。采用水迷宫实验和避暗实验来观察小鼠学习记忆能力;酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测皮质和海马Aβ1-42和Bcl-2的含量,紫外分光光度法检测乙酰胆碱醋酶(acetylcholine esterase,AChE)和乙醜胆碱转移酶(Choline acetyltransferas,ChAT)的活性,水溶性四氮唑法(water-soluble tetrazolium salt 1,WST-1)检测皮质和海马超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性,硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid,TBA)检测皮质与海马丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量;免疫组化法观察Aβ1-42沉淀形成的老年斑情况;苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)观察脑组织形态。结果:与正常对照组比较,模型组的游泳时间和错误次数显著增加(P<K0.01),潜伏期时间显著缩短(P<0.01),皮质和海马中的AChE活性减弱、Aβ 1-42和MDA的含量显著增加(P<0.05),ChAT和SOD活性、Bcl-2含量显著减少(P<0.05),老年斑形成增加,脑组织神经元变形、核固缩、数量减少。与模型组和定志丸组比较,联合用药组的游泳时间和错误次数显著减少(P<0.05),潜伏期时间显著延长(P<0.05),皮质和海马中的AChE活性增强、Aβ1-42和MDA的含量显著降低(P<0.05),ChAT和SOD活性、Bcl-2含量显著升高(P<0.05),老年斑形成减少,脑组织形态明显改善。小结:石菖蒲挥发油联合人参总皂苷能提高D-半乳糖联合氯化铝致AD模型小鼠学习记忆能力的作用。第二部分实验目的:研究石菖蒲挥发油联合人参总皂苷对APP/PS1双转基因AD模型小鼠的学习记忆能力及ACh代谢的影响。方法:将70只APP/PS1双转基因小鼠随机分为7组,雌雄各半,每组10只,即模型组,安理申组(1 mg/kg),人参总皂苷组(75 mg/kg),石菖蒲挥发油组(15 mg/kg),联合用药低剂量组(石菖蒲挥发油15 mg/kg +人参总皂苷75 mg/kg),联合用药中剂量组(石菖蒲挥发油30 mg/kg +人参总皂苷150 mg/kg),联合用药高剂量组(石菖蒲挥发油60 mg/kg +人参总皂苷300 mg/kg)。正常对照组是C57BL/6品系的正常小鼠10只,雌雄各半。模型组和正常对照组用等体积的蒸馏水代替,连续灌胃给药40天。采用水迷宫实验,避暗实验和跳台实验来考察小鼠学习记忆能力;ELISA检测海马Aβ1-42,AChE和ChAT的含量;免疫组化法观察Aβ1-42沉淀形成的老年斑情况;甲基紫法染色观察尼氏体的情况;HE染色观察皮质和海马的组织形态。结果:与正常对照组比较,模型组的游泳时间,错误次数,Aβ1-42和AChE都显著增加(P<0.01),潜伏期和ChAT含量都显著减少(P<0.01),尼氏体数量减少,皮质和海马神经元核固缩明显;与模型组比较,安理申组、人参总皂苷组、石菖蒲挥发油组和联合用药各剂量组的游泳时间,错误次数,Aβ1-42和AChE都显著减少(P<0.01),潜伏期和ChAT含量都显著增加(P<0.01),尼氏体数量有所增加,皮质和海马神经元核固缩减缓,其中联合用药组各剂量之间呈一定的量效关系;与安理申组比较,人参总皂苷组、石菖蒲挥发油组和联合用药各剂量组的游泳时间,错误次数,Aβ1β42和AChE都显著增加(P<0.01),潜伏期和ChAT含量都显著减少(P<0.01),尼氏体数量减少,皮质和海马神经元核固缩明显;与人参总皂苷组和石菖蒲挥发油比较,联合用药各剂量组的游泳时间,错误次数,A β1-42和AChE都显著减少(P<0.05),潜伏期和ChAT含量都显著增加(P<0.05),尼氏体数量有所增加,皮质和海马神经元核固缩减缓。小结:石菖蒲挥发油联合人参总皂苷对APP/PS1双转基因AD模型小鼠的具有提高学习记忆能力,减少Aβ 1-42和ACh的代谢和保护神经元的作用。第三部分实验目的:研究石菖蒲挥发油联合人参总皂苷对APP/PS1双转基因AD模型小鼠的自噬相关因子 Beclin-1,LC3B,p62 和 Bcl-2 的影响。方法:将60只APP/PS1双转基因小鼠随机分为6组,雌雄各半,每组10只,即模型组,联合用药低剂量组(石菖蒲挥发油15 mg/kg +人参总皂昔75 mg/kg),联合用药中剂量组(石菖蒲挥发油30 mg/kg +人参总皂苷150 mg/kg),联合用药高剂量组(石菖蒲挥发油60mg/kg+人参总皂苷300mg/kg),3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3MA)组(30 mg/kg),雷帕霉素组(1 mg/kg)。正常对照组是C57BL/6品系的正常小鼠10只,雌雄各半。3MA组和雷帕霉素组的给药方式是腹腔注射,而正常对照组,模型组和联合用药各剂量组的给药方式是灌胃,模型组和正常对照组用等体积的蒸馏水代替,连续给药40天。采用免疫荧光法检测在海马中Beclin-1的表达;流式细胞术检测海马中LC3B和Bcl-2的表达;Western blot法检测海马中p62的表达;透射电镜观察海马神经元的自噬体结构。结果:与正常对照组比较,模型组的Beclin-1表达和LC3B表达显著增加(P<0.01),Bcl-2表达、p62表达和细胞核的平均光密度(average optical density,AOD)显著减少(P<0.05),自噬体较多。与模型组比较,3MA组和联合用药各剂量组的Beclin-1表达和LC3B表达显著减少(PK0.01),Bcl-2表达、p62表达和细胞核的AOD显著增加(P<0.01),自噬体减少,雷帕霉素组的Beclin-1表达和LC3B表达显著增加(P<0.05),Bcl-2表达、p62表达和细胞核的AOD显著减少(P<0.05),自噬体较多,其中联合用药组各剂量之间呈一定的量效关系;与雷帕霉素组比较,3MA组和联合用药各剂量组的Beclin-1表达和LC3B表达显著减少(P<0.01),Bcl-2表达、p62表达和细胞核的AOD显著增加(P<0.05),自噬体较少;与3MA组比较,联合用药各剂量组的Beclin-1表达和LC3B表达显著增加(P<0.01),Bcl-2表达、p62表达和细胞核的AOD显著减少(P<0.01),自噬体较多。小结:石菖蒲挥发油联合人参总皂苷对APP/PS1双转基因AD模型小鼠的自噬相关因子具有抑制Beclin-1和LC3B的表达,促进p62和Bcl-2的表达的作用。第四部分实验目的:研究石菖蒲挥发油联合人参总皂苷对APP/PS1双转基因AD模型小鼠的PI3K/Akt/mTOR/Becl in-1 通路的影响。方法:将30只APP/PS1双转基因小鼠随机分为3组,雌雄各半,每组10只,即模型组,联合用药高剂量组(石菖蒲挥发油60 mg/kg +人参总皂苷300 mg/kg),LY294002组(1.5mg/kg)。正常对照组是C57BL/6品系的正常小鼠10只,雌雄各半。LY294002组的给药方式是腹腔注射,正常对照组、模型组和联合用药高剂量组的给药方式是灌胃,模型组和正常对照组用等体积的蒸馏水代替,连续给药40天。采用实时聚合酶链反应(Real Time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测在海马中APP mRNA和Beclin-1 mRNA的表达;流式细胞术检测在海马中p-Akt和p-mTOR的表达;Western blot法检测在海马中p-Akt,p-mTOR和Beclin-1的表达。结果:与正常对照组比较,模型组的p-Akt和p-mTOR表达显著减少(P<0.01),APP mRNA和Beclin-1表达显著增加(P<0.01)。与模型组比较,LY294002组的p-Akt,APP mRNA和Beclin-1表达显著减少(P<0.05),而p-mTOR表达显著增加(P<0.01),联合用药高剂量组的 p-Akt,p-mTOR,APP mRNA 和 Beclin-1 表达显著增加(P<0.05);与 LY294002组比较,联合用药高剂量组的p-Akt,APPmRNA和Beclin-1表达显著增加(P<0.05)而p-mTOR表达显著减少(P<0.05)。小结:石菖蒲挥发油联合人参总皂苷可能通过调节PI3K/Akt/mTOR/Beclin-l通路对APP/PS1双转基因AD模型小鼠发挥药理作用。总结论:石菖蒲挥发油联合人参总皂苷对AD模型小鼠有改善学习记忆能力,减低APP、Aβ42的表达和减缓ACh的降解的作用。此使用可能是通过调节PI3K/Akt/mTOR/Becl in-1通路从而抑制自噬来实现的。