论文部分内容阅读
目的： 急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，以骨髓中髓系祖细胞的大量积累为特征。AML的发病机制复杂，由分子学和遗传学异常等多种因素共同组成。类胰蛋白酶（tryptase）是一种丝氨酸蛋白酶，由肥大细胞和某些髓系白血病细胞系如U937和MonoMac6分泌。近年来研究发现AML的部分FAB亚型中也能检测到tryptase的高表达。不同于肥大细胞内的局灶性浸润，AML患者中tryptase呈分散状态分布在细胞质内，同时发现tryptase水平与病情相关，在诱导缓解期间可见tryptase水平明显降低，完全缓解时大多病例恢复正常，持续高水平的tryptase提示存在微小残留病灶以及较高的复发率。我们前期研究发现tryptase可上调血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)的表达。高水平的VEGF水平可能促进白血病细胞的生长、生存和迁移，同时可降低治疗所诱导白血病细胞凋亡的敏感度，从而导致治疗效果较差。这些结果提示tryptase升高与白血病的发生或进展有一定相关性，研究其分子发病机制具有重要的临床意义和科学价值。 C-kit是一种原癌基因，位于染色体4q11-12，其编码产物为CD117，c-kit受体属Ⅲ型酪氨酸激酶家族，其配体是干细胞因子(stem cell factor, SCF)，两者结合后可使c-kit形成二聚体而活化，并激活下游的一系列信号通路，进而调节细胞的增殖与凋亡。过去认为c-kit受体是肥大细胞的标志物，但后来的研究发现广泛表达于造血细胞、黑素细胞及其他组织细胞。研究发现系统性肥大细胞增生病中CD117阳性的患者中tryptase密度明显高于CD117阴性者。同时在AML中发现，c-kit突变型患者血清tryptase水平明显高于野生型患者。C-kit突变可引起c-kit受体发生自身磷酸化而活化，进而持续激活下游信号通路导致细胞无限增殖形成肿瘤。对于c-kit下游信号通路的研究，主要集中在有丝分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)研究，SCF刺激c-kit活化后可引起Erk1/2及p38MAPK的磷酸化，进而激活下游靶基因的转录。 小眼畸形相关转录因子(Microphthalmia associtated transcription factor，MITF)是一种具有碱性/螺旋-环-螺旋(basic/helix-loop-helix，bHLH)结构的转录因子，可通过其“CANNTG”核心结构（E-box结构）与特异的DNA结构相结合。在肥大细胞系中，MITF能通过与tryptase基因启动子区的E-box序列特异性结合，从而调节tryptase基因的转录。有意思的是，在黑素细胞中，通过刺激c-kit，可以活化Erk1/2及p38MAPK信号途径，进而使MITF在Ser73位和Ser409位发生磷酸化，增强MITF的转录活性。最近研究表明，c-kit信号通路的活化可促进MITF表达的这种作用在肥大细胞中也被证实。那么在AML中MITF是否参与了c-kit调节tryptase表达的过程，尚未见相关报道。 为探讨tryptase在AML中的表达调节机制，我们将收集AML患者骨髓单个核细胞，检测c-kit、MITF与tryptase mRNA的表达水平及相关性。继而培养白血病细胞系U937细胞，体外研究SCF/c-kit活化后对tryptase的表达的影响，并进一步探讨其是否通过激活Erk1/2及p38MAPK信号通路及MITF转录因子调节tryptase表达。 方法： 1、患者临床资料和骨髓单个核细胞收集:收集75例AML患者及30例正常对照患者骨髓液各3ml，Ficoll密度梯度离心法提取骨髓液单个核细胞，查阅AML患者年龄、性别、血常规、骨髓原始细胞计数及遗传学改变等临床特征。 2、患者骨髓细胞tryptase、c-kit及MITF mRNA的检测:Triozl法提取RNA，M-MLV逆转录酶合成cDNA，real-time PCR检测tryptase、c-kit及MITF mRNA的表达，最后分析AML患者中三者的相关性。 3、患者骨髓细胞c-kit突变检测与分析:提取DNA，PCR扩增c-kit外显子8和17，通过基因测序得到其DNA序列，测序结果用测序分析软件与GeneBank中的NM000222.2进行对比。 4、细胞培养:U937细胞用含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基，置于37℃，含5％CO2培养箱中培养。 5、WST-1检测U937细胞增殖:不同浓度(0，10，20，50，100ng/ml)重组人SCF(rhSCF)作用于U937细胞24和48h后，WST-1检测SCF对细胞增殖的影响。 6、Real-time PCR检测100ng/ml rhSCF作用于U937细胞24，36和48h后tryptasemRNA表达。 7、流式细胞术检测100ng/ml rhSCF作用于U937细胞24h后CD117表达。 8、Western blot检测100ng/ml rhSCF作用U937细胞24h后p38MAPK及Erk1/2磷酸化蛋白表达的变化。 9、Real-time PCR检测100ng/ml rhSCF作用于U937细胞24h后MITF mRNA表达。 10、ELISA和western blot检测rhSCF作用于U937细胞后tryptase蛋白表达的变化:100ng/mi rhSCF作用于U937细胞24h后，ELISA检测U937细胞培养上清中tryptase含量，western blot检测tryptase蛋白表达。 11、阻断p38MAPK及Erk1/2信号通路后，检测SCF/c-kit诱导tryptase表达的变化:PD98059(20uM)或SB230580(10uM)预处理U937细胞30min，然后加入100ng/ml rhSCF共孵育24h后，real-time PCR检测tryptase mRNA表达的变化，ELISA检测U937细胞培养上清中tryptase含量，western blot检测tryptase蛋白表达。 12、统计分析:统计数据用SPSS17.0软件分析，计量资料用均数±标准差表示。两组资料符合正态分布用t检验，不符合正态分布用秩和检验，率的比较用卡方检验。结果以p＜0.05认为差异有统计学意义。 结果： 1、Real-time PCR显示，AML组(75例)tryptase及c-kit mRNA水平均高于正常对照组（30例）(P＜0.05)，且两者存在显著正相关(r=0.554，P＜0.05);MITF mRNA水平与正常对照无统计学差异，与tryptase及c-kit无相关性。 2、基因测序表明，54例AML患者中检测到6例c-kit外显子17点突变，均为FAB M2亚型，未检测到c-kit外显子8突变。在M2患者中，c-kit外显子17点突变率为22.2％，且c-kit突变型患者的tryptase和c-kit mRNA水平显著高于c-kit野生型患者。 3、通过分析遗传学特征及临床化疗反应与tryptase的关系，在M2亚型中t(8;21)发生率在高表达tryptase组为67％，低表达tryptase组为18％。AML患者(除外M3)第一疗程化疗的完全缓解率在高表达tryptase组为26.6％(4/15)，低表达tryptase组为70％(7/10)。 4、WST-1结果显示，rhSCF可促进U937细胞增殖，呈一定剂量依赖关系。 5、流式细胞术结果显示，rhSCF可促进U937细胞表达CD117。 6、Real-time PCR结果表明，SCF/c-kit信号系统活化可使U937细胞表达MITFmRNA增多，但无统计学意义。 7、Western blot结果显示，rhSCF作用U937细胞24小时后，磷酸化Erk1/2和p38MAPK蛋白显著增多，加入通路抑制剂PD98059及SB230580后表达减低。 8、Real-time PCR、western blot及ELISA结果显示，rhSCF作用U937细胞24小时后，U937细胞表达tryptase mRNA和蛋白显著增加，当加入Erk1/2和p38MAPK特异性抑制剂预处理U937细胞后，此上调作用可被抑制。 结论： 1、SCF/c-kit信号系统的活化是AML细胞高表达tryptase的机制之一。 2、Tryptase高表达可能是伴c-kit突变的CBF-AML患者的治疗靶点之一。 3、Erk1/2和p38MAPK通路参与了SCF/c-kit信号通路上调tryptase的表达。 4、在AML中可能由其他bHLH转录因子而非MITF参与了SCF/c-kit调节tryptase的过程。