论文部分内容阅读
目的：耻垢分枝杆菌Mc2155株感染小鼠RAW264.7巨噬细胞系，观测细胞凋亡及microRNA29a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA155的表达情况，探讨细胞凋亡及microRNA在巨噬细胞抗结核分枝杆菌中所发挥的作用。 方法：不同MOI(1、10)耻垢分枝杆菌Mc2155感染RAW264.7后，稀释平板法检测不同时间点细菌的细胞内增殖情况（CFU）；流式细胞术（ANNEXIN V/PI双染法）检测细胞凋亡情况；ELISA检测细胞培养上清中与凋亡相关的炎症因子TNF-α、IL-1β的分泌水平；Real-time PCR检测细胞中炎症因子（TNF-α、IL-1β、iNOS、Arg-1）、自噬相关基因（atg5、atg7、atg12）、microRNAs（miR29a、miR125b、miR146a、miR155）的表达水平。 结果： 1.耻垢分枝杆菌MC2155感染后，各时间点MOI=1实验组的胞内菌量均小于MOI=10实验组；MOI=1实验组在早期胞内菌量无明显变化，6h到24h缓慢增长；MOI=10实验组，0h到12h胞内菌的增殖无明显波动，24h观察到其急剧增加。 2. Mc2155感染后，与对照组相比，MOI=1组在感染后期（24、48h）两组间差异有统计学意义；MOI=10组在6h、24h与对照组之间的差异有统计学意义。 3. TNF-α和IL-1β的蛋白水平检测结果：MOI=1组在6、24、48h水平均高于对照组，MOI=10组每个时间点都比其他两组水平高，差异均具有统计学意义；但是在上清中三个组均未检测到IL-1β。被感染的细胞胞内TNF-α的mRNA水平在6、12、24h均有上升，48h恢复到正常水平；MOI=1组在感染后24小时其IL-1βmRNA水平上调为对照组的4倍，MOI=10组IL-1βmRNA一直为高水平表达，在24h甚至是对照组的93.9倍；同时还检测了另外两个炎性因子iNOS和Arg-1的mRNA水平，结果提示MOI=1组从12h开始其iNOS mRNA水平逐渐上调，MOI=10组在6h时上调，12h变成轻微下调，24h和48h又为上调，其中24h的表达水平最高；MOI=1组在12h其Arg-1水平上调，在48h出现轻微下调，MOI=10组在48小时发生了并不明显的水平下调。 4.细胞感染后MOI=1组在早期atg5、atg7、atg12的mRNA水平均上调，12h时atg5水平进一步升高，但atg12却下调至正常水平以下，48h时atg7和atg12水平再次上调；MOI=10组在感染6、12h时atg5水平上调，6、24h时atg7水平上调，12h时atg12水平轻微下调。 5.受感染后 RAW264.7表达相应 microRNA的情况：其中，MOI=1组 miR29a在6小时和12小时出现上调，随后下调至正常水平以下，MOI=10组在6小时出现上调，12小时上调显著，随后恢复至正常水平；miR125b与miR146a情况一致，MOI=1组均未观察到起水平的变化，仅在12小时观察到MOI=10组其表达水平上升；miR155在MOI=1组48小时发生下调，MOI=10组12小时其水平上调。 结论：当耻垢分枝杆菌MC2155感染RAW264.7后，自噬在早期发挥了抑制感染的作用；随着时间的延长，microRNA29a和microRNA146a的高表达促进了细菌的增殖，与此同时，microRNA155表达水平上调，诱导细胞分泌TNF-α，促进细胞发生凋亡、促进炎症的发生以抑制细菌的增殖；另外，巨噬细胞来源不同，对耻垢分枝杆菌MC2155的敏感性不同，细胞发生极化的方向也不同。