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目的:评价替莫唑胺缓释微球(TM-MS)治疗C6脑胶质瘤大鼠的有效性及安全性,研究该药有效成分治疗作用的机制,进一步研究该药与抗肿瘤血管生成药物Vatalanib联合化疗的疗效和安全性。方法:一、SD大鼠C6脑胶质瘤模型的建立:细胞培养传代C6胶质瘤细胞,取其对数期细胞,在立体定向指引下,将2×10~6个C6细胞悬液注入大鼠左侧尾状核区,观察动物接种后表现,接种后第6天行头颅MRI检查,并随机抽样处死行HE染色、免疫组化GFAP和PCNA检查,并行透射电镜检查,根据MRI、HE染色、免疫组化和透射电镜结果判定大鼠C6脑胶质瘤模型制作成功。二、TM-MS治疗C6恶性胶质瘤:1、不同剂量替莫唑胺缓释微球治疗C6胶质瘤:将荷瘤大鼠分为5组:对照组、替莫唑胺原药(TM)组、TM-MSⅠ组、TM-MSⅡ组、TM-MSⅢ组。各组化疗均在模型植入C6细胞后第6天进行,对照组切除脑肿瘤表面脑组织;TM组予以口服替莫唑胺50mg/kg/day,连服5天,并切除脑肿瘤表面脑组织;TM-MSⅠ组切除脑肿瘤表面脑组织后植入TM-MS12mg;TM-MSⅡ组切除脑肿瘤表面脑组织后植入TM-MS 16mg;TM-MSⅢ组切除脑肿瘤表面脑组织后植入TM-MS 20mg。治疗14天后分别处死各组动物(各组大鼠中一半用以观察生存期,不予处死),统计平均生存期,计算肿瘤体积和抑瘤率,行PCNA免疫组化检查,评价TM-MS疗效,并寻找合适的TM-MS用药剂量。2、根据上部分获得的TM-MS合适剂量,将TM-MS分别与植入用5-FU和替尼泊甙(VM-26)作疗效对比:将荷瘤大鼠分为4组:对照组、TM-MS组、氟尿嘧啶(FU)组和VM-26组。TM-MS组予以切除脑肿瘤表面脑组织后植入TM-MS16mg,FU组切除脑肿瘤表面脑组织后植入FU 9mg,VM-26组予以VM-26静脉微泵(替尼泊甙3.6mg微泵每日1次,连用3天)。治疗后处死(各组大鼠中一半用以观察生存期,不予以处死),统计平均生存期,计算肿瘤体积和抑瘤率,行PCNA免疫组化检查,评价化疗疗效。3、评价TM-MS间质化疗的安全性:检查间质化疗后血常规、肝肾功能的改变,通过对TM-MS周围脑组织病理学检查评价TM-MS的体内生物相容性。三、TM-MS治疗C6脑胶质瘤大鼠的作用机制:将荷瘤大鼠分为对照组和TM-MS组。治疗方式同前,治疗14天后处死,行透射电镜检查和TUNEL法检测C6细胞凋亡情况,用Western Blot法检测P53蛋白和活化caspase-3蛋白在C6细胞凋亡信号转导途径中的表达水平。四、TM-MS与Vatalanib联合化疗治疗大鼠C6脑胶质瘤:将荷瘤大鼠分为4组:对照组、TM-MS组、Vatalanib组、联合化疗组。TM-MS组治疗方式同前;Vatalanib组从植入C6细胞后行Vatalanib治疗(Vatalanib 5mg口服1/日),治疗20天后处死;联合化疗组从植入C6细胞后开始行口服Vatalanib 5mg治疗,连续治疗20天,并在第6天时加用TM-MS行间质化疗,间质化疗14天后处死(各组大鼠中一半用以观察生存期,不予以处死)。处死大鼠前抽血查血常规、肝功、生化,评价联合化疗的安全性。统计平均生存期,计算测量肿瘤体积变化,行PCNA免疫组化检测,评价化疗对肿瘤细胞增殖能力的影响;检测VEGF和C31评价化疗对肿瘤血管生成的影响;检测ICAM-1和MMP-9的水平,评价化疗对肿瘤间质的影响。结果:一、SD大鼠C6脑胶质瘤模型的建立:本组实验10只SD大鼠有9只在肿瘤细胞种植后一周左右开始出现食欲减退,精神差、活动明显减少,皮毛粗糙,体重减轻。头颅MRI平扫和增强提示:左基底节占位,T1低信号,T2高信号,强化均匀明显,大鼠脑内占位形成。处死后标本GFAP和PCNA检查提示:GFAP在肿瘤细胞胞浆高表达提示肿瘤为神经胶质源性,PCNA在肿瘤细胞胞核高表达表示肿瘤细胞有较高的增殖能力。透射电镜检查显示:肿瘤细胞突触和微绒毛较多,是神经胶质源性肿瘤的特征之一,核内异染色质较多,表明细胞有较高的增殖能力。根据大鼠头颅MRI、免疫组化和电镜结果,说明大鼠C6脑胶质瘤模型成功建立,肿瘤种植成功率较高,达90%。二、替莫唑胺缓释微球治疗C6恶性脑胶质瘤大鼠:1、不同剂量替莫唑胺缓释微球治疗C6胶质瘤:不同对照组、TM组、TM-MSⅠ组、TM-MSⅡ组、TM-MSⅢ组的平均生存期依次为:22.2天、26.0天、26.4天、29.8天和32.4天。抑瘤率依次分别为:17.20%、35.28%、46.99%和48.94%。TM-MSⅡ、Ⅲ组与对照组相比均有明显差异(P＜0.01)。TM-MSⅡmg组与TM-MSⅢ组比较无明显差异提示:中浓度TM-MS和高浓度TM-MS相比疗效无明显差异。各组PCNA阳性率依次为63.2±5.9%、41.7±6.7%、37.5±5.8%、20.2±4.3%、18.8±3.4%。TM-MSⅠ、Ⅱ和Ⅲ组与对照组相比均有明显差异(P=0.0000),TM-MS间质化疗大鼠脑胶质瘤效果明显。TM-MSⅡ组与TM-MSⅢ组比较无明显差异(P＞0.05)提示:中浓度TM-MS和高浓度TM-MS相比疗效无明显差异,考虑高浓度TM-MS可能会对脑组织有更强的刺激,因此TM-MS间质化疗时采用16mg是较合适剂量。2、TM-MS分别与植入用5-FU和替尼泊甙(VM-26)作疗效对比结果:TM-MSⅡ组间质化疗较FU组和VM-26组疗效好,有明显差异(P＜0.01)。3、TM-MS间质化疗的安全性评价结果:TM-MSⅠ组、TM-MSⅡ组、TM-MSⅢ组的血常规、生化、肝功指标均正常,肝、肾病理切片显示未见明显坏死,炎症、水肿等病理改变。TM-MS的病理学结果提示TM-MS的生物相容性较好。三、TM-MS治疗C6脑胶质瘤大鼠的作用机制研究结果:透射电镜显示:C6细胞体积缩小,异染色质浓缩趋边提示该肿瘤细胞发生凋亡。TUNEL法对C6细胞染色显示:对照组肿瘤凋亡细胞阳性率为8.63±1.52%,TM-MS组肿瘤凋亡细胞阳性率为26.24±2.33%,两组间有明显差异(P=0.0000)。Western Blot方法测P53和活化caspase-3结果显示:TM-MS组P53蛋白表达上调,其表达量为对照组的2倍,两组间有明显差异(P=0.0000);TM-MS组活化caspase-3蛋白表达量较对照组高,两组间有明显差异(P=0.0000);四、TM-MS与Vatalanib联合化疗治疗C6胶质瘤:对照组、TM-MS组、Vatalanib组和联合化疗组的平均生存期依次为:21.7天、28.9天、26.4天、22.3天和31.6天。抑瘤率依次分别为:53.15%、16.39%和64.40%。PCNA细胞阳性率依次为:65.2±4.5%、30.1±6.2%、42.3±5.7%、和22.1±4.6%,四组之间存在差异(P=0.0000),TM-MS组与对照组之间有显著差异(P＜0.01),Vatalanib组与对照组之间有明显差异(P＜0.05),联合化疗组与对照组之间有显著差异(P＜0.01),联合化疗组与TM-MS组之间有明显差异(P＜0.05)。四个实验组的VEGF细胞阳性率依次为:70%、60%、50%、和40%,四组之间无明显差异(P=0.5682)。各组的微血管密度依次为:23.24±2.45、18.53±1.53、12.43±0.63、和5.48±0.87个/视野,四组之间存在差异(P=0.0000),TM-MS组与对照组相比有明显差异(P＜0.05),Vatalanib组与对照组之间有明显差异(P＜0.01),联合化疗组与对照组之间有明显差异(P＜0.01)。四个实验组的肿瘤细胞ICAM-1表达存在差异(P=0.0000),Vatalanib组与对照组相比有明显差异(P＜0.01),联合化疗组与对照组之间有明显差异(P＜0.01)。各组MMP-9表达程度存在差异(P=0.0000),TM-MS组与对照组相比有明显差异(P＜0.05),Vatalanib组与对照组之间有明显差异(P＜0.05),联合化疗组与对照组之间有明显差异(P＜0.05)。联合化疗中荷瘤鼠血常规、生化、肝功指标均正常。结论:1、采用立体定向法建立SD大鼠C6脑胶质瘤模型确实可靠,该模型能较好地模拟胶质瘤颅内生长情况,适于胶质瘤间质化疗和全身化疗的实验性研究。2、替莫唑胺缓释微球间质化疗能安全有效地治疗C6脑胶质瘤大鼠。3、替莫唑胺缓释微球通过诱导肿瘤细胞发生凋亡来抑制肿瘤生长。在促进肿瘤细胞凋亡的信号转导中,P53和caspase-3是参与其发生凋亡的重要蛋白质。4、替莫唑胺缓释微球间质化疗联合Vatalanib抗肿瘤血管治疗能安全、更有效地治疗大鼠C6胶质瘤。