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背景和目的血管钙化是糖尿病及慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)患者最常见的并发症之一,与心血管事件的发生密切相关。衰老、炎症、氧化应激、尿毒症、高磷血症、高血糖等是VC发生发展中的重要因素。其中,钙磷代谢紊乱及其引起的高磷血症是诱发血管钙化常见因素。NAD+依赖的去乙酰化酶Sirtuin 1(SIRT1)是一种调节细胞衰老和炎症反应的组蛋白去乙酰化酶,在调控高糖或高磷相关的血管钙化中起着重要作用。然而,高血糖是否可促进高磷血症诱发的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)钙化及其促进钙化的具体机制尚不明确。因此,本研究旨在探讨高糖在高磷诱导VSMCs衰老和钙化中的作用及SIRT1参与其调控的分子机制。方法1.小鼠原代VSMCs的培养与鉴定:分离小鼠胸腹主动脉,利用组织块贴壁法培养小鼠VSMCs,免疫荧光检测平滑肌细胞特异性标记分子平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha,SM22α)和α平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle-actin,α-SMA)。2.以小鼠原代培养的VSMCs作为细胞模型,研究高糖及高磷是否通过影响细胞衰老而促进VSMCs钙化。1)用正常、含高磷和/或高糖的培养基分别处理VSMCs 3天和9天,利用茜素红S染色,细胞内钙含量测定的方法检测每组细胞外钙沉积和细胞内钙含量。Western blot(WB)检测与成骨细胞表型相关的标记分子骨形态生成蛋白(bone morphogenetic protein-2,BMP2)、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor-2,RUNX2)、平滑肌细胞表型分子(α-SMA)和钠磷转运体(type III sodium-dependent phosphate cotransporter-1,Pit1)的表达,从而检测高糖和高磷对VSMCs钙化的影响。2)采用β半乳糖苷酶染色(senescence-associated-β-galactosidas,SA-β-Gal)检测各组细胞衰老情况,WB检测各组细胞中衰老相关的标记分子,如p21、SIRT1蛋白表达水平,从而探究高糖与VSMCs的衰老之间的关系。3.为了研究SIRT1在高糖和高磷诱发衰老及钙化的作用,用含有高糖,高磷以及SIRT1激活剂SRT1720或者抑制剂Sirtinol的培养基处理小鼠VSMCs 9天。采用茜素红S染色法、细胞内钙含量测定检测细胞钙化情况,WB检测与成骨细胞表型相关的标记分子表达;采用β半乳糖苷酶染色以及细胞内衰老相关蛋白p21的检测,进而探讨SIRT1的激活剂与抑制剂对细胞衰老与钙化的影响。细胞衰老和钙化的发生与活性氧(reactive oxygen species,ROS)密切相关,并用流式细胞术检测ROS的水平。4.为了研究SIRT1是否通过调控NF-κB/p53信号通路,进而影响高糖高磷诱导的VSMCs衰老及钙化发生,用SRT1720或Sirtinol处理后,WB检测信号分子p65,p-p65,Ace-p65,p53的表达水平,并用免疫荧光方法检测SIRT1及Ace-p65的表达。结果1.高糖促进高磷诱导的血管平滑肌细胞向成骨细胞转分化相关的钙盐沉积。与对照组相比,茜素红S染色及钙测定结果显示高磷、高糖组VSMCs钙化的发生更明显;WB结果显示,钠磷转运体Pit1,转分化相关标记分子BMP2,RUNX2蛋白表达在高糖、高磷处理后明显增高,并且在高糖高磷共同处理时钙化程度最强。2.药理改变SIRT1活性影响VSMCs向成骨细胞转分化及其钙盐沉积。1)与对照组相比,加入高磷、高糖的处理组中SIRT1的表达明显被抑制,并伴有钙化的发生。2)与对照组相比,在高磷,高糖处理组中加入SIRT1抑制剂Sirtinol后,钙化程度进一步加重;而使用SIRT1激活剂SRT1720处理后,钙化程度却显著被抑制。3.SIRT1调节高糖高磷引起的VSMCs衰老。1)与对照组相比,SA-β-Gal染色发现高浓度磷和葡萄糖组中衰老的细胞增多,该组细胞中的衰老相关标记分子p21表达及活性氧(ROS)水平均明显增高,并且在高糖高磷共同处理组细胞衰老的程度最严重。2)另外,与对照组相比,SIRT1抑制剂组(Sirtinol),加速了细胞衰老及ROS水平。SIRT1激活剂组(SRT1720)ROS水平及细胞衰老程度与未处理组相比明显减弱。4.高糖促进高磷诱导的VSMCs衰老及钙化与SIRT1/NF-k B/p53信号通路有关。1)在高糖高磷处理VSMCs后,WB及免疫荧光结果显示Ace-p65,p-p65,p53蛋白表达明显升高,NF-κB/p53信号通路被活化。2)当使用SRT1720激活SIRT1后,Ace-p65,p-p65,p53活化状态明显被抑制,相反,通过Sirtinol抑制SIRT1后,Ace-p65,p-p65,p53进一步被活化,而p65未见明显变化。免疫荧光SIRT1与Ace-p65结果与WB结果一致。结论1.高糖能够促进高磷诱导的血管平滑肌细胞衰老及钙化。2.高糖能够抑制血管平滑肌细胞去乙酰化酶SIRT1表达。3.SIRT1通过减少p65乙酰化水平,抑制NF-κB/p53的活性,抑制血管平滑肌细胞衰老和向成骨细胞转分化,进而抑制血管钙化。