论文部分内容阅读
通过基因工程手段获得高表达、高纯度的rhKGF2蛋白。运用冻干再水化法制备rhKGF2脂质体,并对制备得到的脂质体进行质量评价。使用rhKGF2(?)旨质体皮肤表面涂抹法检测对C57BL/6脱毛小鼠的毛发再生作用。制备rhKGF2-EGFP融合蛋白脂质体,利用EGFP的荧光特性来检测对小鼠皮肤的渗透性作用。初步探讨rhKGF2脂质体对毛发再生的作用。具体实验方法如下：1.通过基因工程手段,构建pET3c-rhKGF2表达载体并获得稳定的pET3c-rhKGF2-BL21(DE3)工程菌株,通过IPTG诱导表达及各种层析技术获取高表达、高纯度的rhKGF2蛋白,并对纯化得到的rhKGF2蛋白运用高效液相色谱法和MTT法进行纯度及活性的测定。2.利用薄膜分散法制备空白脂质体,再利用冻干再水化法制备rhKGF2(?)旨质体。以包封率为主要指标,通过单因素考察法对脂质体的制备工艺及配方进行优化,以确定最佳的制备工艺及配方。通过最佳制备工艺及配方制备rhKGF2(?)旨质体3.对制备好的rhKGF2(?)旨质体进行质量评价,评价项目包括：外观、SDS-PAGE鉴定、形态学、粒径分布、zeta电位、包封率、生物学活性、渗漏率、物理稳定性常数KE、体外释放性。4.通过皮肤涂抹给药法,研究rhKGF2(?)旨质体对C57BL/6小鼠的毛发再生作用。对小鼠的皮肤进行组织病理学考察,以确定rhKGF2脂质体药物对小鼠毛发再生的作用。5.通过基因工程手段,构建pET3a-rhKGF2-EGFP表达载体并获得稳定的pET3a-rhKGF2-EGFP-BL21(DE3)工程菌株,通过IPTG诱导表达及各种层析技术获取rhKGF2-EGFP蛋白,并对纯化得到的rhKGF2-EGFP蛋白运用Western Blot,MTT法进行性质和活性的测定。6.利用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的强荧光特性,制备rhKGF2-EGFP脂质体,通过小动物活体成像技术研究rhKGF2-EGFP脂质体的小鼠皮肤渗透性作用。具体实验结果如下：1.得到表达稳定的rhKGF2菌株,rhKGF2的表达量达30%,纯度达98%以上,对NIH3T3细胞存在有效的生物学活性。2.通过单因素考察法对脂质体的制备工艺及配方进行优化,确定最佳的制备工艺及配方为：①蛋黄卵磷脂与胆固醇的质量比4：1；②0.9%NaCl缓冲液,pH7.0；③hKGF2投药量50μg/mL;④孵育温度37℃；⑤孵育时间为20min;⑥于60-120PSI条件下,每5min为1循环,微射流20min。通过最佳制备工艺及配方制备rhKGF2脂质体的包封率为(77.47±3.78)%,并且具有较好的重现性。3. rhKGF2脂质体为澄清、透明、均匀的乳白色乳液,无分层现象,并伴有微弱的淡蓝色光发出；rhKGF2脂质体个体形状较规则,呈现圆球形或椭圆球形颗粒,大小较均一；rhKGF2(?)旨质体的粒径范围为210～260nm之间,在10nm左右出现一个小峰,可能是rhKGF2脂质体在冻干过程中出现的异常。粒径范围完全符合rhKGF2脂质体的粒径范围；rhKGF2脂质体对NIH3T3细胞具有促增值作用,且与rhKGF2蛋白溶液样品对NIH3T3细胞的促增值作用基本一致,而空白脂质体不具有促细胞增殖活性。由此可见,rhKGF2(?)旨质体的制备及脂膜成份对rhKGF2的促细胞增殖活性基本没有影响。4. rhKGF2(?)质体对脱毛小鼠的毛发再生作用明显优于rhKGF2溶液,其作用效果略优于阳性药物米诺地尔。空白脂质体作用效果与生理盐水相当,说明空白脂质体对脱毛小鼠的毛发再生不存在效果。病理学结果显示,rhKGF2脂质体能够有效促进毛囊的新生与成熟,并且不存在炎症反应,达到理想的作用效果。5.得到表达稳定的rhKGF2-EGFP菌株,rhKGF2-EGFP的表达量达7%,纯度达97%以上,(?)(?)NIH3T3细胞存在有效的生物学活性。6. rhKGF2-EGFP(?)旨质体对皮肤的渗透性随时间的延长而增强,在小动物活体成像仪下观察SD大鼠的皮肤,可见在涂抹脂质体1h后,荧光特性便开始出现,3h后达到最大值,时间继续延长荧光特性开始消失,可能原因为由于时间过长,蛋白质开始降解。rhKGF2-EGFP溶液均未观察到荧光,说明本研究制备的脂质体剂型在促进rhKGF2蛋白药物渗透方面起到了显著的作用。