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目的:探究KGN和TGF-β3在体外培养下对兔骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响;制备PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶,研究该温敏水凝胶应用于软骨组织工程的可行性。探究包裹KGN和TGF-β3的PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶复合骨髓间充质干细胞对兔膝关节骨软骨缺损修复的影响。方法:1.采用单层细胞培养体系和软骨球培养体系评估KGN和TGF-β3对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响。分离提取兔骨髓间充质干细胞,使用流式细胞技术和三系分化鉴定提取细胞。分别将BMSCs离心成细胞团块和种植于共聚焦小皿中,采用不同组分的成软骨诱导液分别诱导21天。通过HE、阿利新蓝组织学染色和Ⅱ型胶原的免疫荧光染色,成软骨相关基因和软骨肥大相关基因RT-PCR检测,评价KGN和TGF-β3对骨软骨间充质干细胞成软骨分化的作用。2.合成PLAG-PEG-PLGA三聚体,通过水凝胶倒置瓶实验,探究不同浓度PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶的临界凝胶温度。通过溶胀率、降解率和细胞增殖实验、Live/Dead荧光染色评价PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶的理化性质和生物相容性。将KGN和TGF-β3负载于温敏水凝胶内,研究KGN和TGF-β3在体外的释放过程。3.建立兔双侧膝关节骨软骨缺损模型,分成4组:KGN+TGF-β3组,植入复合BMSCs的KGN和TGF-β3温敏水凝胶;TGF-β3组,植入复合BMSCs的TGF-β3温敏水凝胶;空白水凝胶组,植入复合BMSCs的温敏水凝胶;空白对照组,无植入物。分别在术后8周和16周取材,进行大体形态评分、组织学染色和评分,评估包裹KGN和TGF-β3复合骨髓间充质干细胞的PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶对兔膝关节软骨缺损的修复影响。结果:1.通过流式细胞检测和三系分化鉴定所分离的细胞是骨髓间充质干细胞。成软骨诱导21天后,软骨球细胞切片的组织学染色、免疫荧光染色及RT-PCR检测表明KGN和TGF-β3能协同增强成软骨分化效果。2.PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶溶液的临界凝胶温度随浓度的增加而提高,20%温敏水凝胶溶液的临界凝胶温度为37℃。20%PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶的溶胀率4h后趋于稳定。浸入PBS缓冲液24d后,温敏水凝胶分解了24%。20%PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶对细胞生长和增殖无影响且能稳定释放KGN和TGF-β3。3.KGN+TGF-β3组骨软骨修复情况较其他三组更好,不仅体现在大体形态和评分中,还体现在组织学染色和评分中。8周和16周后,KGN+TGF-β3组大体形态评分和组织学评分均高于其他三组(P<0.05)。但是16周后,TGF-β3组和空白水凝胶组在大体形态评分和组织学评分差异没有统计学意义(P>0.05)。结论:1.在单层细胞培养体系和软骨球培养体系下,KGN和TGF-β3能显著促进兔骨髓间充质干细胞的成软骨分化,并且二者存在协同效应。KGN能抑制TGF-β3所引起的软骨肥大相关基因的高表达。此外,在KGN和TGF-β3联合应用中,100n M KGN具有更优的成软骨诱导效果。2.当PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶浓度为20%时,温敏水凝胶在37℃下2min稳定凝胶。20%PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶具有优良的溶胀率、降解率和生物相容性,可以在体外负载兔骨髓间充质干细胞。包裹KGN和TGF-β3的PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶能在37℃下持续稳定释放KGN和TGF-β3。3.包裹KGN和TGF-β3复合BMSCs的PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶能促进兔膝关节骨软骨缺损修复。在体内实验中KGN和TGF-β3的联合应用能促进软骨组织再生,且对软骨修复具有协同增强作用,为KGN、TGF-β3和PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶在临床应用中提供依据。