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随着糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)病程的进展,转化生长因子-β1(Transforming growthfactor-β1,TGF-β1)/Smads通路在腎小管-间质纤维化的病变中发挥着重要的作用。转录共抑制因子SnoN(Ski-related novel protein N)作为TGF-β1/Smads通路的负调节因子,在细胞内严密的控制着该通路的转导和效应。我们前期研究发现,SnoN蛋白在DN肾小管上皮细胞中的表达随着病程的发展进行性减少,并伴有肾间质细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的沉积和肾小管上皮细胞表型转化。体外研究显示,在高糖培养的肾小管上皮细胞SnoN蛋白表达下调的同时,纤连蛋白(fibronectin,FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscleactin,α-SMA)的表达上调。而用siRNA敲低SnoN后,FN、α-SMA的表达进一步上调,肾小管上皮细胞纤维化的病变进一步加重,表明SnoN蛋白表达下调参与了 DN的发病机制。然而关于DN时肾小管上皮细胞SnoN蛋白表达减少的机制尚不清楚,需进行大量研究。目的本课题观察控制血糖对糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠肾组织SnoNmRNA和蛋白、TGF-βl的表达的影响,以期进一步了解DN发病中SnoN表达与TGF-βl/Smads通路之间的关系。同时,本研究选用靶向沉默Smad2和Smad3基因的siRNA分别处理肾小管上皮细胞(NRK-52E细胞)以减少目的蛋白的表达,并进行高糖培养后观察SnoN mRNA和蛋白表达变化,以明确TGF-β1/Smads通路对SnoN蛋白表达调控的机制。本研究还以高糖培养的NRK-52E细胞为研究对象,试图从基因转录和蛋白稳定性两个方面,进一步探讨高糖状态SnoN表达减少的调控机制,为有效治疗DN、研发新药物和制定新治疗方案,提供理论和实验依据。方法1.采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)尾静脉注射复制大鼠DM模型。DM大鼠从成模13周(w)起,用甘精胰岛素治疗,以血糖控制在10mmol/L以下,尿糖阴性为准,分别于成模16w和24w时处死,同时设鼠龄匹配的正常对照组和DM组。应用生化方法测血糖和24h尿蛋白;HE、PAS和Masson染色光镜观察肾形态学改变;免疫组织化学和Western blot检测肾组织中SnoN、TGF-β1、Smurf2和Arkadia蛋白表达,并同时检测EMT相关指标E-钙黏素(E-cadherin)、α-SMA和ECM主要成份FN、胶原蛋白Ⅲ(CollagenⅢ,Col-Ⅲ)、胶原蛋白 I(CollagenI,Col-I)蛋白的分布和表达;实时荧光定量聚合酶连反应(Real time fluorescent quantitative-PCR,qRT-PCR)技术检测SnoN mRNA的表达。2.采用免疫荧光染色检测上皮细胞标志性蛋白角蛋白-18(cytokeratin-18,CK-18)、E-cadherin和间质细胞标志性蛋白α-SMA在NRK-52E细胞的表达和分布,观察细胞形态、生长状态;免疫荧光染色或免疫荧光双染检测E-cadherin、α-SMA、FN在不同糖环境肾小管上皮细胞的表达和分布;采用siRNA干扰技术敲低肾小管上皮细胞中Smad2和Smad3的表达,Western blot和qRT-PCR技术检测敲低目的基因的效率;分别降低肾小管上皮细胞Smad2和Smad3蛋白后,予以正常糖[DMEM(含糖5.5 mmol/L)+ 2%FBS]和高糖[19.5mmol/L D-glucose + DMEM + 2%FBS]环境培养48h;应用Western lott方法检测高糖环境下,减少肾小管上皮细胞Smad2或Smad3蛋白表达对SnoN、Smad2、Smad3、磷酸化Smad2[Phospho-Smad2(Ser465/467)(p-Smad2)]、磷酸化Smad3[Phospho-Smad3(Ser423/425)(p-Smad3)]、Akradia、E-cadherin、α-SMA和Col-Ⅲ蛋白表达的影响;qRT-PCR技术检测SnoN mRNA的表达变化;3.给予不同剂量蛋白酶抑制剂MG132(1μmol/L、2μmol/L、5mol/L)预孵育后高糖环境培养48h,并设正常糖和高糖对照组,应用Western blot技术检测各组肾小管上皮细胞中SnoN和Smad7、Smurf2和Arkadia蛋白表达,并同时检测E-cadherin、α-SMA和Col-I的蛋白表达;以24wDM大鼠为研究对象,应用免疫组织化学和Western blot方法检测各组大鼠肾组织中SnoN、BMP-7、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3、Smurf2和Arkadia、以及E-cadherin、α-SMA和Col-Ⅲ蛋白的分布和表达,qRT-PCR技术检测SnoN mRNA的表达;4.NRK-52E细胞予以不同剂量骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein 7,BMP-7)(10ng/ml、20ng/ml)加入正常糖或高糖环境培养48h,并设正常糖和高糖对照组,Western blot方法检测各组细胞SnoN、TGF-β1/Smads通路、Smurf2和Arkadia、以及E-cadherin、α-SMA和Col-Ⅲ蛋白的表达,qRT-PCR技术检测SnoN mRNA的表达变化;5.NRK-52E细胞予以不同剂量肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)(1 Ong/ml、20ng/ml)加入高糖环境培养48h,并设正常糖和高糖对照组,Western blot方法检测各组细胞SnoN、细胞外信号调节激酶1和2(extracellular signal-regulated kinase-1 and-2,ERK1/2)信号通路及E-cadherin、α-SMA和Col-Ⅲ蛋白的表达,qRT-PCR技术检测SnoNmRNA的表达。结果1.生化指标和组织形态学改变表明DM大鼠模型复制成功,模型稳定,并已伴发DN;与正常对照组相比,DM大鼠肾组织SnoN蛋白表达减少但mRNA表达增高,伴有TGF-β1、Smurf2和Arkadia蛋白表达增加,E-cadherin蛋白表达减少而α-SMA、FN、Col-Ⅲ、Col-Ⅰ蛋白大量增多;控制血糖能增加DM大鼠肾组织SnoN蛋白的表达但渐少其mRNA的表达,同时TGF-β1、Smurf2和Arkadia蛋-白表达下调,并伴有尿蛋白和肾纤维化的改善,及E-cadherin蛋白的表达增加和α-SMA、FN、Col-Ⅲ、Col-Ⅰ的蛋白减少;2.NRK-52E细胞转染Smad2 siRNA、Smad3 siRNA后高糖培养,分别使Smad2、Smad3mRNA及总蛋白表达下降,同时降低了 SnoN mRNA的表达;而与单一高糖培养组相比,NRK-52E细胞转染Smad2siRNA后SnoN蛋白表达进一步减少,Smad3蛋白磷酸化增强,Arkadia蛋白表达增多,并且E-cadherin下调,α-SMA、Col-Ⅲ蛋白增多;相反,NRK-52E细胞转染Smad3 siRNA后SnoN蛋白表达增加,Smad2蛋白活化增强,Arkadia蛋-白减少,伴有E-cadherin表达增加和α-SMA、Col-Ⅲ表达减少;3.NRK-52E细胞在高糖环境培养48h后,E-cadherin表达明显减少,而α-SMA、FN表达增多;MG132可抑制高糖诱导的NRK-52E细胞SnoN和Smad7蛋白减少,上调E-cadherin蛋白表达而减少α-SMA和Col-Ⅰ蛋白的表达,并呈量效依赖性,但对Smurf2和Arkadia蛋白表达没有影响;4.动物实验结果显示,随DN病程的进展,大鼠肾组织SnoN mRNA表达增加但蛋白减少,TGF-β1/Smads通路活化,Smurf2,Arkadia表达增加;而BMP-7表达下调,伴有EMT的发生和ECM在间质沉积,肾功能严重受损。体外实验结果显示,外源性BMP-7可上调SnoN在转录和蛋白水平的表达,抑制了高糖诱导NRK-52E细胞表型转换及ECM生成,但对TGF-β1/Smads通路活化及Smurf2,Arkadia的蛋白表达没有影响;5.外源性HGF可上调SnoN在转录和蛋白水平的表达,抑制了高糖诱导NRK-52E细胞表型转换及ECM生成,并且可能是通过活化ERK1/2通路上调肾小管上皮细胞SnoN表达。结论1.在DM条件下,高表达的TGF-β1可诱导SnoN mRNA的表达,但同时增多的E3泛素连接酶Smurf2和Arkadia,在活化的TGF-β1/Smads通路介导下促进SnoN蛋白降解,该效应使TGF-β1对SnoN的调控表现出对蛋白降解作用强于对其的转录活化作用,最终使得SnoN在蛋白水平显著减少。而通过控制血糖,则从相反的角度证明了 TGF-β1对SnoN表达调控的双重机制;并且,控制血糖延缓或减轻DN的纤维化病变的机制,可能与上调SnoN蛋白表达有关。2.Smad2或Smad3蛋白的活化都参与上调SnoN在转录水平的表达,但Smad3蛋白的活化促使SnoN蛋白的降解作用增强,加速DN的进程,而Smad2抑制SnoN蛋白的降解则延缓DN的发展。3.蛋白酶抑制剂MG132能恢复SnoN和Smad7蛋白的表达延缓或阻断DN肾小管EMT的发生和ECM的合成,其机制可能不是通过减少E3泛素连接酶Smurf2、Arkadia的表达,而是抑制蛋白酶体降解靶蛋白的活性所致;4.外源性BMP-7可能通过加强肾小管上皮细胞SnoN mRNA的表达上调其蛋白水平,从而改善DN及肾脏纤维化病变,而不是通过直接抑制TGF-β1/Smads信号通路或抑制E3泛素连接酶对SnoN蛋白的降解来实现。5.HGF在DN过程中发挥抗纤维化效应可能是通过活化ERK1/2通路上调SnoN mRNA表达,阻断或对抗高糖介导肾小管上皮细胞EMT过程和间质ECM的沉积实现的。