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牡丹皮为毛莨科芍药属植物牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)干燥根皮。《神农本草经》中记载“牡丹皮主寒热,中风瘛疭、痉、惊痫邪气,除症坚淤血留舍肠胃,安五脏,疗痈疮[1]”。由《中国药典》(2010版)“清热凉血,活血化瘀,用于热人营血,温毒发斑,吐血衄血,夜热早凉,无汗骨蒸,经闭痛经,跌扑伤痛,痈肿疮毒。”相反牡丹皮炭品的药效与牡丹皮药材疗效相反,从最早有文字记载制炭药物的文献《五十二病方》至今,炭药的应用已有两千多年的历史。据古代文献金元医家以“十灰散”治痨症咯血、吐血,牡丹皮炭品属于寒凉药作为其中主要成分之一,创“血冷则凝,见黑则止”[2]。 牡丹皮是“炒炭存性”、“一物两性”的典型代表,药物功效的改变主要是药效物质基础的变化,通过不同炮制方法使药物中的化学成分发生了不同变化。药材及药材炮制品的质量对药物的临床疗效有重要影响主要包括药材生品的产地、药材公司的加工方法、药材炮制方法。因药材饮片公司及药材加工厂的药材炮制主要靠炮制经验未有相对统一具体的炮制工艺,导致不同饮片具有质量差异。近几年来国内外对牡丹皮及牡丹皮炮制品的质量评价标准不外乎是从外观及单一化学成分的含量,然而外观性状来判断具有主观性,而单一化学成分的含量测定不能完整准确的反应药材的质量和临床疗效。故本课题根据多方文献资料及预实验结果采用多指标对牡丹皮及牡丹皮炭的进行定性分析及对其质量控制指标进行初步探讨,同时建立牡丹皮及其炭品指纹图谱的共有模式,并采用HPLC法测定10个化学成分含量,并以此为标准对不同产地、不同炮制程度的药材进行分析比较,初步探讨了牡丹皮炭品止血机理为后续深入研究奠定基础。 第一指纹图谱色谱条件的筛选,通过对药材提取方法,流动相、HPLC仪器温度、波长、流速等方面的实验结果得出牡丹皮及其炮制品用50%甲醇超声提取90 min,采用流动相乙腈:0.1%甲酸-水,柱温30℃,流速为1.0 ml.min-1,在254 nm下进行梯度洗脱,得出的HPLC指纹图谱峰形较好分离度良好。采用上述色谱条件分别建立牡丹皮生品、牡丹皮炭品的高效液相指纹图谱,并比较不同产地的生品及炮制品指纹图谱差异,实验结果得出牡丹皮共有模式具有较高相似度均在0.930以上;牡丹皮炭品共有模式也具有较高相似度均在0.950以上;分别比较不同产地牡丹皮及其炮制品的相似度值良好但有个别差异;比较牡丹皮生品及炭品的相似度较差,通过与标准品的对比大致确定了牡丹皮10个主要化学成分并从指纹图谱比较中得出炮制过程中丹皮酚、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、槲皮素、山奈素、异鼠李素的峰面积随炮制程度的增加而显著下降,而化合物没食子酸峰面积增加,但炮制程度太过时峰面积显著降低,并有新成分鞣质5-羟甲基糠醛生成。 第二测定牡丹皮及其炭品的含量,通过HPLC方法构建10个不同类别化学成分的含量测定方法。通过方法学考察实验得出10个化学成分具有良好精密度RSD均小于2.0%;重复性实验10个成分具有良好重复性RSD均小于3.0%;且加样回收率良好均在95%-105%之间,故采用上述方法分别对牡丹皮及其炭品进行10个成分含量测定。结果表明炮制后儿茶素、丹皮酚、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、槲皮素、异鼠李素、山奈素含量显著降低,而没食子酸的含量随之增加并有新生化合物5-羟甲基糠醛。并通过PCA主成分分析结果得出牡丹皮生品与炭品形成两个明显独立区域,表明炮制前后化学成分含量明显变化;5-HMF、没食子酸、槲皮素含量变化成为影响区别的主要因素。 第三不同产地及不同炮制程度含量测定比较不同炮制品、不同产地、不同炮制程度的10个化学成分的含量,实验结果得出不同产地牡丹皮生品及炭品的化学成分的含量有不同差异;通过PCA主成分分析及聚类分析结果得出不同炮制程度牡丹皮炭品的丹皮酚、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、槲皮素、山奈素、异鼠李素、儿茶素随着炮制程度的增加含量随之降低,化学成分中5-HMF和没食子酸的含量随程度的增加而增加,但炮制程度太过时含量逐渐降低。