背景:血压昼夜节律异常与高血压患者预后息息相关,研究血压昼夜节律异常的发生机制对高血压治疗意义重大。既往研究提示叶酸降同型半胱氨酸（Hcy）治疗伴随夜间血压降低,从而恢复正常的血压昼夜节律。本课题组在前期基于人群的临床研究中发现:高血压患者中高Hcy水平与血压昼夜节律异常波动显著相关;并且在女性患者中,血管内皮功能越差的高血压患者夜间血压降低幅度越小。然而,迄今为止,仍无高同型半胱氨酸（HHcy）干扰血压昼夜节律的相关病理生理分子机制研究。血压昼夜节律受多种因素影响,越来越多的研究表明,哺乳动物中内源性生物钟可通过时钟基因的表达变化来调控血压昼夜节律,时钟基因主要位于大脑下丘脑视交叉上核和外周组织中,其中包括血管系统。为此,我们从血管内皮功能角度,探索HHcy是否能通过影响内皮细胞中时钟基因的表达节律,进而干扰正常的血管内皮功能,最终影响血压昼夜波动节律。目的:阐明高同型半胱氨酸培养对血管内皮细胞核心时钟基因Bmal1、Clock、Per2以及内皮型一氧化氮合酶（e NOS）表达节律的影响,明确HHcy是否可以通过破坏血管时钟基因的表达节律,干扰内皮细胞e NOS的正常表达,进而改变血管内皮功能,最终影响血压的昼夜波动节律。方法:1、选取人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为实验模型,通过CCK8检测不同Hcy浓度下（0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L）,HUVECs 24h、48h的细胞存活率情况以及结合相关预实验确定Hcy处理组浓度水平。2、通过高浓度胎牛血清（50%FBS）的培养基孵育HUVECs 2h,建立体外培养的内皮细胞时钟基因表达出现类似光照刺激引起的周期性波动节律。3、通过RT-PCR、Western bloting检测空白对照组、高浓度Hcy（400μmol/L）处理组不同时间点（0 h,4 h,8 h,12 h,16 h,20 h,24 h,28 h,32 h,36 h,40 h,44 h,48h）HUVECs中时钟基因Bmal1、Clock、Per2以及e NOS的m RNA和蛋白表达情况。4、通过硝酸还原酶法检测空白对照组、高浓度Hcy（400μmol/L）处理组不同时间点（0h,6h,12h,18h,24h,30h,36h,42h,48h）HUVECs培养液中NO含量情况。结果:1、CCK8结果显示:Hcy浓度水平在0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L时,HUVECs细胞存活率大于80%、细胞状态良好;Hcy浓度水平为800μmol/L时,HUVECs细胞存活率不足80%、细胞状态略差。2、RT-PCR、Western bloting结果显示:在高浓度胎牛血清（50%FBS）培养基中孵育2h后,HUVECs中时钟基因的表达节律性被成功诱导,表现为时钟基因Bmal1、Clock、Per2在0h,4h,16h,20h,24h,28h,40h,44h,48h处表现为低表达水平,在8h,12h,32h,36h处表现为高表达水平,总体呈现规律的周期性节律波动。与空白对照组相比,HHcy组在8h,12h,32h,36h处时钟基因Bmal1、Clock、Per2m RNA表达和蛋白表达均表现为表达水平下调;与空白对照组相比,HHcy组在0h,4h,16h,20h,24h,28h,44h,48h处时钟基因Bmal1、Clock、Per2的m RNA表达和蛋白表达均无明显差异;与空白对照组相比,HHcy组在40h处时钟基因Bmal1、Clock的m RNA表达和蛋白表达以及Per2 m RNA表达也无明显差异;不同的是,在40h处相较空白对照组,HHcy处理组Per2蛋白表达水平下调明显。3、RT-PCR、Western bloting结果显示:在高浓度胎牛血清（50%FBS）培养基中孵育2h后,HUVECs中e NOS的表达出现了与时钟基因表达一致的规律的周期性节律。与空白对照组相比,HHcy组在8h,12h,32h,36h处e NOS m RNA表达和蛋白表达均表现为表达水平下调,HHcy组在0h,4h,16h,20h,24h,28h,44h,40h,48h处e NOS m RNA表达和蛋白表达无明显差异。4、硝酸还原酶法检测NO含量结果显示:48h内空白对照组HUVECs培养液中NO含量无明显变化;与空白对照组相比,48h内HHcy组HUVECs培养液NO含量显著增加。结论:高同型半胱氨酸抑制人脐静脉内皮细胞中时钟基因Bmal1、Clock、Per2以及e NOS的表达节律并且促进人脐静脉内皮细胞分泌NO。