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何首乌(Polygonum Multiforum Thunb.)作为我国一种传统中药已有许多年的历史,长期应用于临床和保健品等多方领域。近些年来国内外学者对何首乌的药理、生理及临床应用等作了大量的研究,证实其次生代谢产物蒽醌类化合物是何首乌生理活性中最重要的有效成分。然而,何首乌的代谢途径基础研究较薄弱,远远落后于人参、青蒿等代谢途径较明确的药用植物的有效成分研究。因此,目前还难以通过全基因组测序了解其有效成分的生物合成途径及调控机理。cDNA克隆不仅包含完整的阅读框,还拥有5和3端的非编码区,是进行高通量功能基因研究的一条有效途径。
本实验以三年生何首乌成熟叶组织为材料,构建了叶组织cDNA文库。何首乌噬菌体cDNA文库经滴度和重组率检测合格后,转化为噬菌粒cDNA文库,用PCR和双酶切的方法鉴定文库的质量,并随机挑取克隆子利用T3引物进行5端EST测序,EST对应的是cDNA序列,特异性表达的基因,cDNA文库的构建有利于深入研究这些基因在组织中的表达情况和表达的丰度,进而揭示何首乌有效成分生物合成的机理奠定了物质基础。
本实验的结果如下：
1.通过改良的CTAB法提取何首乌的总RNA,电泳结果显示28S和18S条带清晰明亮,OD260/OD280的值在1.80～1.98之间,无明显降解现象。并通过反转录验证了所提的RNA;
2.构建了噬菌体cDNA文库,初始文库滴度为1.07×106pfu/mL,重组率为97.2％；扩增文库的滴度为8.67×109pfu/mL,重组率为98.5％；
3.利用PCR和双酶切的方法检测插入片段的大小,得出片段的范围均在500bp～2000bp之间,验证了文库中插入片段的长度与载体上连接的片段大小相符；
4.5端单向ESTs测序,获得57条有效的ESTs,经过NCBI中的蛋白数据库BLASTx和BLASTn相似性比对,发现有17条(29.8％)为已知功能注释,15条(26.3％)为编码未知蛋白的基因,10条(17.5％)为新基因；
5.对17条已有功能注释的基因按其功能进行分类：
1)参与蛋白合成和降解相关的基因,检测到翻译起始因子4A(eIF4A)、编码核糖体的蛋白和过氧化氢酶；2)参与能量代谢相关的基因,包括丙酮酸脱羧酶基因、碳酸酐酶基因、果胶酯酶基因、编码ADP/ATP转位酶的基因；
还检测到基因转录和细胞防卫有关的基因,以上蛋白相关基因的高丰度表达,意味着何首乌体内的能量代谢旺盛,可以产生足够的ATP以供给蛋白(酶)合成和分泌,最终促进相关化学成分的合成。