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研究目的特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）是一种间质性肺病（Interstitial lung disease,ILD）,具有很高的病死率,目前尚缺乏有效的治疗手段。传统中药是我国医学的重要组成部分,而且其有效单体成分的提取及使用是目前新药开发、老药新用的热点之一。汉防己甲素（tetrandrine,TET）是从防己植物根部提取的生物碱,具有抗炎、免疫调节、抑制纤维增生等多种作用。已有研究报道,汉防己甲素具有抗纤维化作用,且被用于矽肺的临床治疗,但其在特发性肺纤维化中的治疗作用及其机制仍不明确,需进一步探讨。研究方法1、构建博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型,分别从造模后的第1天（预防组）或第8天（治疗组）开始每天腹腔内注射汉防己甲素,第21天处死小鼠。运用HE染色观察汉防己甲素对纤维化肺组织结构的作用,Masson染色及羟脯氨酸试剂盒来检测对肺间质胶原蛋白沉积及分布的影响,免疫组化及Western Blot 检测对蛋白 α-SMA、vimentin、collagen-Ⅰ、fibronectin 表达的影响。2、利用TGF-β1诱导的肺成纤维细胞构建体外纤维化模型,给予汉防己甲素治疗后,通过Western Blot、免疫荧光检测纤维化相关蛋白α-SMA、vimentin、collagen-Ⅰ、fibronectin 的表达。3、使用Western Blot、免疫荧光、电镜、mRFP-GFP-LC3串联荧光腺病毒、小干扰RNA、免疫共沉淀（Co-IP）等方法证明汉防己甲素可促进选择性自噬。4、利用免疫荧光共定位、免疫共沉淀（Co-IP）方法检测collagen-Ⅰ与SQSTM1和MAP1LC3的定位及相互作用。染色质免疫共沉淀（ChIP）实验检测转录因子NRF2与SQSTM1启动子区域结合。5、Western Blot、免疫荧光等方法证明汉防己甲素抑制Rheb/mTOR信号通路,进一步将构建的Rheb质粒转入成纤维细胞,探究Rheb在汉防己甲素调控肺纤维化中的作用。6、统计学处理:数据表示为均数±标准差,采用GraphPad Prism软件进行统计分析。两独立样本组间比较采用t检验;多组间单因素比较采用One-way ANOVA;多组间两因素比较采用Two-way ANOVA,进一步使用Dunnett或Tukey法进行多样本均数的多重比较。研究结果1、汉防己甲素对肺纤维化小鼠肺组织病理形态学的影响:与肺纤维化模型组相比,汉防己甲素预防性治疗组及汉防己甲素纤维化治疗组均可以改善肺部结构紊乱,降低Ashcroft评分,减少肺组织胶原蛋白的沉积及成纤维细胞活化标记物α-SMA的表达。2、汉防己甲素对肺成纤维细胞的增殖、活化及细胞外基质沉积影响的研究:①汉防己甲素可降低TGF-β1诱导的成纤维细胞α-SMA、vimentin、collagen-Ⅰ、fibronectin 的蛋白表达及 p-smad2、p-smad3 的表达。②与TGF-β1组相比,汉防己甲素治疗组显著抑制肌成纤维细胞的增殖。3、汉防己甲素对TGF-β1诱导的成纤维细胞的选择性自噬的影响:①通过生物信息学网站预测证明汉防己甲素通过调节凋亡和（或）自噬信号通路改善肺纤维化。②随着汉防己甲素浓度的增加,凋亡标记物cleaved caspase3的表达及凋亡细胞数量无明显变化,提示汉防己甲素不影响成纤维细胞的凋亡途径。③汉防己甲素可显著增加TGF-β1诱导的肺成纤维细胞内自噬相关蛋白MAP1LC3Ⅱ、SQSTM1的表达和自噬小体的数量。与此同时,使用自噬抑制剂3MA或siATG7抑制自噬,可明显减弱汉防己甲素对α-SMA、vimentin、collagen-Ⅰ、fibronectin蛋白表达的抑制作用,提示汉防己甲素通过促进自噬改善肺纤维化。④与TGF-β1组相比,汉防己甲素治疗组可增加SQSTM1与MAP1LC3B和泛素化蛋白的共定位及相互作用。进一步实验结果证实汉防己甲素可显著增加collagen-Ⅰ与MAP1LC3B及溶酶体标记物LAMP2的共定位,同时加强collagen-Ⅰ与SQSTM1的相互作用,提示汉防己甲素通过促进SQSTM1介导的选择性自噬增加collagen-Ⅰ的降解。⑤通过NCBI和JASPAR网站预测提示SQSTM1的启动子区域存在NRF2识别并结合的序列,进一步使用ChIP-PCR实验证实汉防己甲素可以增加NRF2在SQSTM1的启动子区域的结合能力,提示汉防己甲素通过调节NRF2增加SQSTM1的蛋白表达。⑥与TGF-β1组相比,汉防己甲素治疗组显著抑制Rheb的活性,进而通过抑制mTOR的磷酸化促进自噬。使用质粒过表达Rheb可显著减弱汉防己甲素对α-SMA、vimentin、collagen-Ⅰ、fibronectin蛋白表达的抑制作用,提示汉防己甲素通过Rheb/mTOR信号通路活化自噬。结论本课题通过体内外实验证明汉防己甲素可缓解肺纤维化。汉防己甲素通过抑制Rheb/mTOR信号通路促进SQSTM1介导的选择性自噬,从而抑制成纤维细胞的活化、促进胶原蛋白的降解;同时,汉防己甲素可通过NRF2上调SQSTM1的表达进一步促进选择性自噬,实现抗肺纤维化的作用。本研究为汉防己甲素运用于肺纤维化的临床防治提供了一定的实验基础。