研究背景和目的:肝肺综合征(Hepatopulmonary syndrome,HPS)是在肝病和/或门静脉高压的背景下由肺内微血管扩张(intra-pulmonary microvascular dilation,IPVD)引起的动脉低氧血症以及年龄相关的异常肺泡动脉氧分压差。肝肺综合征在肝硬化患者中的发生率在5%至32%之间。肝肺综合征的发生显著增加了患者的死亡率,而肝移植被认为是唯一有效的治疗措施。胆总管结扎(common bile duct ligation,CBDL)大鼠是目前唯一被广泛接受的肝肺综合征动物模型。研究发现肺血管新生在CBDL大鼠肝肺综合征的发生发展中起到重要作用,然而这一过程背后的机制仍有待进一步研究。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)被认为是血管生长的调控者,因为它们具有转分化成内皮细胞(endothelial cells,ECs)或旁分泌作用的潜力。多年来,MSCs在不同类型疾病中的治疗作用已经受到广泛的关注,特别是在创伤或局部缺血疾病中的治疗应用。然而,关于MSCs参与疾病病理性血管新生过程的研究相对较少。骨髓MSCs(BM-MSCs)的动员可以发生于多种刺激,包括慢性缺氧、炎症和损伤。在CBDL的早期阶段,肝脏和远端器官可能被增多的胆红素、内毒素和炎症介质所损伤。同时,由于缺氧过程伴随在CBDL的整个晚期阶段,这表明BM-MSCs可能在肝肺综合征大鼠模型中被动员。基质衍生因子-1/C-X-C趋化因子受体4(stromal cell-derived factor 1/C-X-C chemokine receptor type 4,SDF-1/CXCR4)是BM-MSCs中的重要趋化因子/趋化因子受体信号轴,它们不仅在恶性肿瘤的转移和浸润中起关键作用,而且在BM-MSCs的定向迁移中也起到重要作用。结合以上证据,我们推测BM-MSCs可能在肝肺综合征的肺血管新生过程中起一定作用。Nf-E2相关因子2(Nrf2)是一种转录因子,可以激活各种抗氧化反应元件(ARE)依赖基因以应对氧化应激反应,在我们以前的研究发现,CBDL手术3周后的大鼠肺组织中磷酸化Akt和ERK1水平增加,并且这些信号分子的磷酸化已被证明可以激活Nrf2。有研究已经证实在氧化损伤情况下,Nrf2可以控制干细胞存活,并且Nrf2的活化程度在细胞复制沉寂期和衰老期间下降。此外,有研究还发现Nrf2的激活促进了造血干细胞中CXCR4的表达。因此,本研究中,我们检测了CBDL大鼠外周血中MSCs的数量,探索了CBDL大鼠血清对BM-MSCs的促血管生成功能的影响,包括其定向迁移、增殖和旁分泌能力。实验研究方法(分为四步):1.改良法CBDL手术构建HPS大鼠模型以及原代BM-MSCs的培养为了构建HPS大鼠模型,相比之前的研究,我们使用了改进后的方法对雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(200-250g)进行CBDL操作。假手术组动物仅仅暴露胆总管但是不结扎。收集肺组织和外周血用于进一步研究分析。从SD大鼠的股骨和胫骨中分离原代BM-MSCs,并使用MSCs完全培养基进行培养。培养3-5代后的BM-MSCs用于体外进一步实验。2.PB-MSCs和BM-MSCs的CFU-F测定和流式细胞术鉴定将所有分离的骨髓细胞以8×104/cm2的密度接种在25cm2培养瓶上,并在完全培养基中培养。对于PB-MSCs,则以4×105/cm2的细胞密度接种分离的外周血单个核细胞。培养的第8天在显微镜下计数CFU-F的贴壁菌落(>50个细胞)。使用LSR II流式细胞仪(BD Biosciences)检测表面标志物,并用Flow Jo软件分析。3.用CBDL大鼠血清处理的BM-MSCs中促血管生成功能的测定体外培养的BM-MSCs分别用CBDL大鼠血清处理12小时,24小时和48小时。通过Western印迹检测PCNA和CXCR4的蛋白表达水平,通过ELISA法测定BM-MSCs的VEGF旁分泌水平。此外,通过MTT和transwell试验测定其增殖和迁移能力。4.CBDL大鼠血清诱导Akt/Nrf2信号通路激活与BM-MSCs促血管生成功能增强的关系体外培养的BM-MSCs用Nrf2 si RNA转染或用Akt或Erk抑制剂处理,然后分别用Sham大鼠及CBDL大鼠血清刺激。通过Western印迹法检测p-Akt、p-Erk、Nrf2、PCNA和CXCR4的表达,通过ELISA法测定BM-MSCs的VEGF旁分泌水平。进行transwell和MTT试验以进一步检测BM-MSCs的增殖和迁移功能。实验结果:1.CBDL大鼠中MSCs的动员增加CBDL大鼠的外周血中获取的MSCs,其CFU-F的平均值为10.2±3.6/106个细胞,相比之下,假手术大鼠的外周血中MSCs的CFU-F为1.4±0.8/106个细胞。然而,CBDL大鼠的和假大鼠骨髓中获取的MSCs的CFU-F集落数之间没有显著差异,分别为每106个细胞有35.2±7.4和37.8±5.8个CFU-Fs。2.BM-MSCs和PB-MSCs的特征及鉴定细胞培养24小时后,大量的细胞簇随机分布在培养板的底部。原代细胞在培养的第5天显示出成纤维细胞样的形态,并达到80%的融合率,在第7-8天时可发现细胞集落。通过流式细胞术检测发现,BM-MSCs和PB-MSCs细胞对CD29和CD44标记均显示为阳性,而对CD34和CD45标记均显示为阴性。这些结果表明,BM-MSCs和PB-MSCs的特征是一样的。3.CBDL大鼠血清促进BM-MSCs中CXCR4,PCNA的表达及其旁分泌活性CXCR4和PCNA分别是细胞定向迁移和增殖能力的指标,Western印迹结果显示它们的表达水平以时间依赖性方式显著增加。与这一结果相一致,MTT测定结果也显示在CBDL大鼠血清的作用下MSCs的增殖能力明显提高。我们还发现,HPS组中血清刺激48小时后其VEGF旁分泌水平是对照组的185%,而单独的HPS培养基中VEGF的含量与对照组培养基的量相似,并显著低于BM-MSCs条件培养基中VEGF的水平。4.Akt/Nrf2信号通路介导了CBDL大鼠血清诱导的BM-MSCs增殖、迁移和旁分泌功能增强的作用我们发现CBDL血清诱导后,BM-MSCs中Nrf2的蛋白表达及核转位水平显著增加,而在使用Akt抑制剂LY294002处理后,这种作用明显减弱。同时我们发现Erk抑制剂PD98059却没有引起类似作用。另外,我们还发现阻断Akt/Nrf2信号通路能够明显抑制CBDL血清刺激导致的BM-MSCs增殖、迁移和旁分泌功能的增强,而阻断Erk/Nrf2途径并不能达到这种效果。结论:这些结果表明CBDL大鼠外周血中MSCs的数量增加,Akt/Nrf2通路在促进BM-MSCs的促血管生成功能中起着至关重要的作用,其可能是HPS中肺血管新生的有效促进者。