研究背景:在世界范围内,乳腺癌已经成为了女性恶性肿瘤中最常见的类型之一,女性的乳腺癌患病风险及死亡风险在近年来逐渐攀升,严重威胁着女性的生命健康。乳腺癌是一种异质性极高的疾病类型,大约有15-20%的乳腺癌患者被诊断为三阴性乳腺癌,三阴性乳腺癌具有生长速度快、转移时间早、复发率高以及缺乏有效的诊疗靶点等特点,因此该部分患者的预后相较于其他乳腺癌类型较差。三阴性乳腺癌特殊的生物学行为及临床病理学特点是影响患者生存的重要因素,因此深入探索其分子机制,对于提升三阴性乳腺癌患者的治疗效果、改善生存预后情况具有重要意义。环状RNA（circular RNA,circRNA）是由前体RNA经反向剪接形成的共价闭合环形RNA。内源性的circRNA在真核生物中广泛存在,大量研究结果显示,circRNA的异常表达在恶性肿瘤的表观遗传学调控方而起到了至关重要的作用,其已经成为癌症研究的前沿领域。已有报道circRNA可以作为“海绵”并通过内源性竞争结合的机制吸附microRNA,以此发挥非编码RNA的生物学功能。然而根据文献报道,大多数的circRNA都是由基因的外显子区域转录出来的,该部分circRNA大多位于细胞质内,并且很多外显子circRNA的序列中会含有与其本底基因类似或重合的ORF区域,因此该部分circRNA可能具有翻译蛋白的潜能。已被证明一些circRNA可以作为模板翻译出新型的蛋白,在结肠癌、肝癌以及其他肿瘤中也有相关报道,但是有关蛋白编码circRNA在三阴性乳腺癌中的功能及分子机制仍不明确,亟待进一步的深入研究。为了寻找与TNBC进展转移密切相关的circRNAs,我们联合高通量测序技术及生物信息学分析,选取了在发生转移的乳腺癌组织及高转移能细胞亚系231M中高表达的circ-EIF6作为我们后续研究的目标,并通过体内体外实验及临床标本检测对circ-EIF6的功能及分子机制进行了深入的探讨。第一部分三阴性乳腺癌进展转移相关circRNAs的筛选及表达分析研究研究目的1.筛选与TNBC进展转移相关的circRNAs;2.检测乳腺癌组织及细胞系中circ-EIF6的表达水平;3.探讨circ-EIF6的表达水平与TNBC癌患者临床病理学特征及预后的相关性。研究方法利用高通量测序技术筛选与三阴性乳腺癌进展转移密切相关的circRNAs。利用qRT-PCR技术检测circ-EIF6在乳腺癌细胞系中的表达水平。随后选取TNBC患者的肿瘤组织,检测circ-EIF6在组织中的表达水平。最后,利用统计学方法分析circ-EIF6的表达水平与TNBC患者临床病理学特征及预后的相关性。研究结果我们发现,circ-EIF6在发生转移的乳腺癌组织及231M细胞系中均显著高表达,并且circ-EIF6在三阴性乳腺癌细胞系中的表达显著高于其他细胞系。进一步的临床病理特征及预后分析发现,circ-EIF6的表达水平与TNBC患者的组织学分级及远处转移密切相关,并且circ-EIF6的高表达能够提示TNBC患者的不良预后。研究结论1.Circ-EIF6在发生转移的乳腺癌组织及高转移能细胞亚系231M中显著高表达;2.Circ-EIF6的表达水平在三阴性乳腺癌细胞系中显著高于非三阴性乳腺癌细胞系;3.Circ-EIF6的表达水平与三阴性乳腺癌患者的临床病理学特征及预后密切相关。第二部分Circ-EIF6环状特性及蛋白编码特性的研究研究目的1.验证circ-EIF6是否具有circRNA的基本环状特性;2.验证circ-EIF6是否能够作为模板翻译出新型蛋白EIF6-224aa;3.检测EIF6-224aa是否在TNBC细胞及组织中普遍存在。研究方法利用基因组学对circ-EIF6的基因组来源进行分析,通过PCR、琼脂糖凝胶电泳、Sanger测序等方法验证circ-EIF6在TNBC细胞中是否存在,利用RNase R、放线菌素D及PCR等实验对circ-EIF6的环状特性进行验证。利用RNA-FISH及核质分离实验对circ-EIF6的细胞亚定位进行验证,采用多聚核糖体分析验证circ-EIF6是否能够与核糖体结合。通过双荧光素酶报告基因及Western blot等实验验证circ-EIF6是否具有蛋白翻译的功能。利用考马斯亮蓝染色、蛋白质谱检测、EIF6-224aa特异性抗体检测等实验验证EIF6-224aa是否在TNBC组织及细胞系中普遍存在。研究结果Circ-EIF6是由EIF6基因的3-7外显子转录并反向拼接环化而成,其长度为906nt,利用反向引物能够在TNBC细胞中扩增出circ-EIF6的特异性剪接点。同时circ-EIF6具有抵抗RNase R消化及半衰期更长的环状特性,且不具备线性RNA的相关特性,表明circ-EIF6 是一个 circRNA。Circ-EIF6主要位于TNBC细胞的细胞质内,并可以与细胞内的核糖体相互结合。同时circ-EIF6的RNA序列中含有IRES元件以及一个长度为675nt的ORF区域,该IRES元件具备起始circ-EIF6蛋白翻译的功能,因此circ-EIF6具备翻译出一个长度为224个氨基酸的新型蛋白（EIF6-224aa）的能力。利用蛋白质谱检测及Western blot实验我们证明了 EIF6-224aa在TNBC组织及细胞中内源性、普遍性地存在。研究结论1.Circ-EIF6具有circRNA的基本环状特性;2.Circ-EIF6能够作为模板翻译出新型蛋白EIF6-224aa;3.EIF6-224aa在TNBC细胞及组织中普遍存在。第三部分Circ-EIF6通过编码EIF6-224aa促进三阴性乳腺癌进展转移的功能研究研究目的1.探究干扰circ-EIF6对TNBC细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响;2.探究circ-EIF6是否通过编码EIF6-224aa促进TNBC细胞的增殖、迁移及侵袭能力。研究方法利用MTT、克隆形成等体外功能实验验证circ-EIF6及其蛋白产物EIF6-224aa对TNBC细胞增殖能力的影响;利用Transwell以及划痕实验验证circ-EIF6及其蛋白产物EIF6-224aa对TNBC细胞迁移及侵袭能力的影响。最后,利用体内动物实验进一步验证circ-EIF6对TNBC细胞进展转移能力的影响。研究结果通过体外功能实验,我们发现干扰circ-EIF6能够显著抑制TNBC细胞的增殖、迁移及侵袭能力;利用过表达实验,我们进一步证明了 circ-EIF6可以通过编码EIF6-224aa促进TNBC的增殖、迁移及侵袭能力。裸鼠皮下成瘤模型及尾静脉注射肺转移模型显示,过表达circ-EIF6能够在体内促进TNBC细胞的进展转移能力。研究结论1.干扰circ-EIF6能够抑制TNBC细胞的增殖、迁移及侵袭能力;2.Circ-EIF6能够通过编码EIF6-224aa促进TNBC细胞的增殖、迁移及侵袭能力。第四部分Circ-EIF6通过编码EIF6-224aa促进三阴性乳腺癌进展转移的分子机制研究研究目的1.筛选并验证EIF6-224aa的下游作用靶点;2.探究EIF6-224aa对MYH9的影响及分子作用机制;3.阐明EIF6-224aa通过调控MYH9进而影响TNBC细胞进展转移的分子机制。研究方法利用Co-IP及质谱分析技术筛选EIF6-224aa的下游作用靶点,利用免疫荧光、软件预测及Co-IP实验验证EIF6-224aa与MYH9的相互结合。利用CHX、MG132及Co-IP实验检测EIF6-224aa对MYH9稳定性及泛素化水平的影响。进一步干扰MYH9,利用MTT及Transwell实验检测MYH9对EIF6-224aa功能的影响,并通过Western blot及qRT-PCR实验检测下游Wnt/beta-catenin通路的变化。研究结果利用Co-IP及蛋白质谱分析技术,我们发现EIF6-224aa可能能够与MYH9蛋白相互结合。利用免疫荧光技术我们证明了 EIF6-224aa与MYH9具有相同的亚细胞定位,利用预测软件我们发现EIF6-224aa具有与MYH9相互结合的潜能。利用Co-IP实验进一步证实了 EIF6-224aa能够直接与MYH9相互结合。此外,我们证明了 EIF6-224aa能够通过降低MYH9的泛素化水平以稳定MYH9的蛋白表达。最后,通过体外功能实验我们发现干扰MYH9能够抑制EIF6-224aa的生物学功能,而过表达EIF6-224aa则能够激活 MYH9 下游 Wnt/beta-catenin 通路。研究结论1.MYH9是EIF6-224aa的下游直接作用靶点;2.EIF6-224aa能够降低MYH9的泛素化水平并稳定MYH9的蛋白表达;3.EIF6-224aa能够激活MYH9的下游Wnt/beta-catenin通路,进而促进TNBC细胞的进展转移能力。