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目的:研究降钙素基因相关肽对气道上皮损伤后修复过程的影响,并探讨其胞内信号转导途径。
方法:(1)CGRP对人气道上皮损伤修复的影响:以人支气管上皮细胞(hliman bronchial epithelial cells,HBECs)株为研究对象,观察CGRP对HBECs损伤修复指数的影响;免疫细胞化学方法检测HBECs增殖相关抗原Ki67的表达;流式细胞仪检测CGRP对HBECs S期细胞百分率(SPF)和细胞增殖指数(PI)的影响。(2)胞内信号转导的研究:以HBECs为研究对象,观察PKC抑制剂H-7和MAPK抑制剂PD98059对CGRP促损伤修复作用的影响;采用凝胶迁移滞后实验(EMSA)检测cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response elementbinding protein(CREB)与DNA的结合活性,观察CGRP对其结合能力的影响及PKC、MEK信号途径在其中的作用。
结果:
1.CGRP对人气道上皮损伤修复的影响
(1)在体外培养的HBECs细胞层机械刮擦造成缺损。24h后,对照组缺损处已全部长满,损伤修复指数(RI)为4.3。随着CGRP浓度的增加,10<-10>mol/L~10<-7>mol/L CGRP可使HBECs的损伤修复速度明显增快,RI分别为5.8、6.1、6.7、7.6。与对照组相比,差异具有显著性(P<0.05)。提示CGRP可明显促进HBECs损伤后的修复,且呈浓度依赖性。
(2)与对照组Ki67阳性细胞标记指数(LI)值相比,CGRP处理24h后,HBECs的Ki67表达明显增加,p<0.01;呈浓度依赖性,提示CGRP可明显促进HBECs Ki67的表达。
(3)与对照组相比,加入CGRP(10<-8>mol/L)24h后IIBECs的细胞周期发生明显变化,S期细胞百分比由(31.3±3.5)%上升到(49.4±5.7)%,G2/M期细胞百分比由(16.5±1.6)%上升到(24.6±1.9)%, (p<0.05)。结果表明,CGRP可明显增强HBECs的增殖。
2.CGRP促HBECs损伤修复的胞内信号转导的研究
(1)与对照组相比,在CGRP处理组中分别加入H-7和PD98059后,CGRP对HBECs损伤修复速度的促进效应被逆转(P<0.01)。可见CGRP发挥促HBECs损伤修复作用与PKC和MAPK途径有关。
(2)与对照组相比,CGRP处理组HBECs LI值明显增大,加入H-7及PD98059预处理可阻断CGRP促Ki67表达的效应(P<0.01)。
(3)与CGRP处理组相比,加入H-7及PD98059预处理HBECs,CGRP的促SPF及PI效应被逆转(p<0.01),提示CGRP对HBECs促增殖效应的发挥与PKC及MAPK途径有关。
(4)与对照组相比,CGRP可显著提高HBECs CREB与DNA的结合活性(P<0.01),其效应可被H-7阻断,差异有显著性(P<0.01)。与CGRP处理组相比,CGRP+PD98059组HBECs CREB与DNA的结合活性无明显变化。可见,CGRP可显著提高HBECs CREB与DNA的结合活性,其效应的发挥与PKC途径有关,而与MEK途径关系不明显。
结论:
1.CGRP可加快HBECs的损伤修复过程。
2.CGRP可促进HBECs的增殖。
3.CGRP促HBECs损伤修复及增殖效应的发挥与PKC及MAPK胞内信号转导途径有关。
4.CGRP可通过PKC提高HBECs CREB与DNA的结合活性。