前言：　　三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate，ATP)是体内组织细胞一切生命活动所需能量的直接来源，作为细胞内能量传递的“分子通货”，储存和传递化学能。蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合成都需要ATP的参与，可促使机体各种细胞的修复和再生，增强细胞代谢活性，在生理和病理状态下起到了非常重要的作用。研究表明ATP在心血管系统中具有非常关键的作用。在心肌细胞中，钙离子的跨膜转运需要消耗大量的能量，ATP为其能量的重要来源之一。有研究发现，ATP可缩短患者心脏发作时间，或缩短患者接受心脏手术后的恢复时间，并且，ATP可改善因心脏压力造成的心脏能量低的状态，因此，ATP在维持心脏功能方面起到了非常重要的作用。　　L型钙通道是一种电压依赖性钙通道，其由4个亚单位组成，分别为α1，α2δ，β1-4和γ，其中α1亚单位是主要的功能单位。钙离子信号与很多重要的生理功能密切相关，而L型钙通道严格控制着钙离子进出细胞的过程，因此，研究L型钙通道的精细调节机制至关重要。许多研究表明，ATP对心肌细胞L型钙通道(Cav1.2)有重要的调节作用，应用膜片钳技术进行研究发现豚鼠心室肌细胞在单通道记录模式下，L型钙通道存在Run-Down现象，进一步研究发现只有在ATP存在的条件下钙调蛋白(calmodulin，CaM)才能恢复钙通道的活性，单独应用CaM不能很好地恢复L型钙通道的活性，提示ATP在L型钙通道的调节过程中必不可少。　　目前的研究结果显示，ATP对L型钙通道的调节主要通过两种途径，一种为磷酸化途径，另一种为非磷酸化途径。磷酸化途径在最近几年得到了广泛的研究，ATP通过蛋白激酶磷酸化L型通道上的某些氨基酸，来维持通道活性;而也有研究提出，ATP对L型钙通道的调节也很有可能通过非磷酸化的途径来实现，然而，非磷酸化调节存在很多途径，例如ATP可直接结合到通道上，或是通过细胞骨架的改变进行调节，此外，还有通过ATP依赖的磷脂酶发挥作用等。本研究发现，ATP可能通过直接与心肌Cav1.2钙通道结合对其进行调节，而且这种结合是CaM和钙离子依赖性的;进一步的实验寻找ATP在钙通道上的结合部位，发现ATP可以和Cav1.2钙通道的近碳末端和氮末端结合。　　本研究探明了ATP对L型钙通道调节新机制，不仅为L型钙通道的调节提供了新的理论基础，也为临床涉及到ATP的疾病治疗提供了新的思路。　　目的：　　基于ATP对L型钙通道调节作用机制的研究，明确除了磷酸化途径，是否还存在非磷酸化调节途径，并且进一步探究非磷酸化调节途径的具体调节机制;明确细胞因子对ATP调节作用的影响。本研究不仅为ATP对L型钙通道的调节作用提出新的作用机制，同时，也为L型钙通道的调节相关研究提供更为丰富的理论基础。　　实验材料和方法：　　1、材料　　健康雌性豚鼠，体重300-600g，均由日本鹿儿岛大学实验动物部提供。谷氨酸（Amresco公司），HEPES（Amresco公司），蛋白酶(Sigma公司)，胶原酶（日本Yakult公司），蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics GmbH），Cav1.2钙通道N末端和C末端抗体(anti-Cav1.2 of N-terminus alomone labs, and anti-Cav1.2 ofcarboxyl terminus StressMarq Biosciences), Strepavidin-HRP(BETHYLL-ABORATORI-ES.INC)，生物素标记的ATP(Affinity photoprobes)，Western blot电泳槽和转移槽(美国Bio-Rad; Mini VE)，超高速离心机（佐久间制造所日本），凝胶自动成像仪(DAHAN Korea)。　　2、方法　　电生理学分析:采用膜片钳技术，同时应用生物素标记的ATP和CaM，检测其对L型钙通道活性的恢复作用。　　超高速离心方法制备膜蛋白:豚鼠心肌组织在蛋白裂解液中匀浆后，采用超高速离心的方法，得到含有Cav1.2钙通道蛋白的总蛋白，并应用WGA-Sepharose对Cav1.2钙通道进行进一步的纯化。　　蛋白与蛋白结合实验:将分离纯化的Cav1.2钙通道蛋白与生物素标记的ATP孵育，同时，进一步应用免疫印迹的方法，对ATP与Cav1.2钙通道的结合进行进一步的鉴定。　　重组蛋白的制备:采用液氮反复冻融的方法及化学药物分离法，制备CaM和Cav1.2钙通道(CT1，CT2，CT3，NT)的GST标签的融合蛋白。　　统计学分析:各组结果以平均数±标准误表示，两组间比较用t检验。多组间比较用Dunnetts检验。　　结果：　　1、应用膜片钳技术，在膜内向外记录的模式下，不同类型生物素标记的ATP(EDA-ATP-Biotin和6-AH-ATP-Biotin)，与CaM同时应用，检测了对L型钙通道的Run-Down现象的恢复作用。结果表明EDA-ATP-Biotin对L型钙通道的Run-Down现象具有恢复作用，为进一步的ATP与L型钙通道的结合实验奠定基础。　　2、本实验通过超高速离心的方法从豚鼠心肌组织中提取纯化了全长Cav1.2钙通道蛋白，应用生物素标记的ATP与全长Cav1.2钙通道蛋白孵育，然后通过免疫印迹的方法，采用生物素的抗体，检测ATP是否与全长Cav1.2钙通道结合。实验结果表明，ATP(8N3ATP-Biotin)能与全长Cav1.2钙通道蛋白结合。　　3、采用不同浓度的8N3 ATP-Biotin(ATP)与全长Cav1.2钙通道进行蛋白结合实验，发现ATP能够剂量依赖性地与全长Cav1.2钙通道蛋白结合。同时，应用软件对得到的数据进行分析，发现可能ATP在钙通道上存在至少2个结合位点，蛋白结合参数:Bmax1=1.0886，kd1=0.0721mM; Bmax2=1.0994，kd2=0.5323mM。由此推测，可能ATP与这2个结合位点的亲和力不同，一个具有较高亲和力，另外一个为相对较低亲和力。　　4、本研究在不同分子数的CaM情况下，检测ATP与心肌Cav1.2钙通道的结合情况，实验结果表明在较少分子数CaM的情况下，CaM有促进ATP与Cav1.2钙通道结合的作用，而随着CaM分子数的增加，CaM则有抑制ATP与Cav1.2钙通道结合的作用，由此可见，CaM在调节ATP与L型钙通道结合过程中具有双相调节作用。　　5、本研究检测了在不同[Ca2+](0 nM，80nM，250nM，500 nM，1μM)的情况下，ATP与Cav1.2钙通道的结合情况。实验结果证实，在[Ca2+]为80nM的情况下，ATP与Cav1.2钙通道的结合作用最强，与其他浓度进行比较，具有显著差异性。　　6、本实验应用ATP与不同的Cav1.2钙通道片段CT1，CT2，CT3和NT进行蛋白与蛋白结合实验，检测ATP的结合情况，结果显示ATP能够与CT1和NT结合，几乎不与CT2和CT3结合。　　7、基于ATP与不同片段结合情况的实验结果，对ATP结合的强度进行了分析，发现ATP与CT1有较强的结合作用，与NT的结合相对较弱。前面的实验结果表明，1分子Cav1.2钙通道蛋白，至少结合2个分子ATP，所以推测可能这2个分子分别与CT1和NT结合。　　结论：　　1、应用膜片钳细胞贴附和膜内向外的记录模式，检测EDA-ATP-Biotin和6-AH-ATP-Biotin对L型钙通道活性的恢复作用，其中EDA-ATP-Biotin能够恢复和维持L型钙通道的活性。　　2、ATP可与心肌Cav1.2钙通道直接结合。并且CaM剂量依赖性影响ATP与Cav1.2钙通道结合作用。同样，Ca2+也剂量依赖性影响ATP与Cav1.2钙通道结合作用。　　3、ATP可以与Cav1.2钙通道的CT1和NT结合，并以与CT1结合更强。与CT2和CT3基本不结合。　　上述结果提出了ATP通过直接结合作用调节L型钙通道的新机制。