核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一种世界广泛分布危害严重的病原真菌,至少能造成400多种植物发病。生防菌盾壳霉(Coniothyrium minntans)是核盘菌的一种重寄生真菌,对核盘菌引起的作物菌核病有很好的生防潜力。盾壳霉可以通过抗生作用或重寄生作用来控制核盘菌,而盾壳霉的抗生作用或重寄生作用受环境p H值的调控。Lae A是一种全局性的次级代谢调控因子,可以调控真菌的次级代谢和发育,例如在Aspergillus、Fusarium、Penicillium和Trichoderma属等真菌中已有报道。但在盾壳霉中还没有Lae A基因及其功能研究的相关报道。那么Lae A在盾壳霉的次级代谢和发育中有何作用?本研究采用简并引物同源扩增技术从盾壳霉基因组中克隆得到Cmlae A基因,并通过PEG介导的原生质体转化技术对Cmlae A基因进行敲除和互补,最后对Cmlae A在盾壳霉重寄生和抗生作用中的功能进行了研究,取得如下结果:首先,从盾壳霉野生型菌株Chy-1中克隆到Lae A基因及其启动子序列,将其命名为Cmlae A(Gen Bank登录号:KP998106)。Cmlae A基因全长2017bp,包含6个外显子,5个内含子,1749bp的开放阅读框共编码583个氨基酸。对其氨基酸序列进行分析发现,Cmlae A氨基酸序列中含有Lae A蛋白的保守结构域(S-腺苷甲硫氨酸结合域)。系统进化分析结果表明:Cmlae A与Pyrenophora tritici-repentis的Lae A亲缘关系最近,氨基酸同源性高达80%。q RT-PCR试验结果表明Cmlae A在24 h黑暗条件下增强表达,Cmlae A在24 h光照条件下的表达量仅为24 h黑暗条件下的0.179倍。其次,通过同源重组技术获得了Cmlae A的敲除突变体ΔCmlae A-2和互补转化子ΔCmlae A-2C。不论在光照还是黑暗条件下,各突变体在PDA平板上菌丝生长速率与野生型无显著差异,但Cmlae A敲除突变体不能产生分生孢子器与分生孢子,而且其菌落的表面疏水性丧失。可见,Cmlae A显著影响盾壳霉分生孢子器、分生孢子的产生和菌落表面疏水性,而且这些生物学特性不受光照调控。然后,明确了Cmlae A对盾壳霉重寄生作用的影响。重寄生试验结果表明,Cmlae A敲除突变体对核盘菌菌丝和菌核的寄生能力显著低于野生型和互补转化子ΔCmlae A-2C。进一步检测重寄生相关酶的产生情况,Cmlae A敲除突变体产生的胞外蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶显著低于野生型和互补转化子ΔCmlae A-2C。因此,Cmlae A基因的敲除导致盾壳霉产生重寄生相关酶(胞外蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶)的能力下降,从而显著降低了盾壳霉对核盘菌的重寄生能力。此外,还研究了Cmlae A对盾壳霉抗生作用的影响。在PDB摇培条件下,敲除突变体ΔCmlae A-2产生的抗真菌物质显著高于野生型和互补转化子ΔCmlae A-2C,同时Cmlae A敲除突变体培养滤液的p H值显著低于野生型和互补转化子ΔCmlae A-2C。在MCD缓冲p H值条件下,只有在p H值为5.0的条件下,Cmlae A敲除突变体的培养滤液几乎没有抑菌活性,显著低于野生型和互补转化子;而在p H为3.0、4.0和6.0时,Cmlae A敲除突变体培养滤液的抑菌活性与野生型和互补转化子没有显著差异,而且各盾壳霉菌株在高p H值条件产生抗真菌物质能力下降。因此,Cmlae A敲除突变体在PDB摇培条件下抗生活性增强可能是由于其培养液p H值降低所造成的。综上所述,Cmlae A在盾壳霉与核盘菌互作中发挥重要作用,不仅影响盾壳霉的无性发育(分生孢子器、分生孢子)和疏水性,而且还影响盾壳霉的生防功能-重寄生作用和抗生作用。