我国是全球结核病流行严重的国家之一,在结核病的预防控制中,我国面临的最大难题之一就是如何快速准确地对早期结核感染者做出诊断。目前,培养出结核分枝杆菌是诊断结核的金标准,但培养时间长,不利于早期诊断和治疗。传统的免疫学诊断方法结核菌素皮肤试验(TST)则存在着敏感性低、特异性差的缺点,检出结果可信度不高。所以本研究计划通过检测结核病组、未感染结核组的结核分枝杆菌抗原特异性T细胞比例,建立基于流式胞内细胞因子检测的结核感染诊断方法,同时将流式检测结果与T-SPOT结果进行对比分析,进一步确认流式胞内细胞因子检测结核特异性T细胞在结核感染诊断方面的应用价值；此外,将针对PD-1和SLAM的单克隆抗体与结核特异性抗原ESAT-6/CFP-10共刺激,以期望提高结核杆菌抗原T细胞的功能,使得流式检测法能够更加灵敏、准确；在确立该方法的建立后,通过流式胞内细胞因子检测,对重组的结核分枝杆菌ESAT-6/CFP-10变态反应原用于结核病临床辅助诊断试验前后病人细胞因子的分泌情况做一个总体评价,从而为结核的临床研究提供帮助。1.流式细胞术诊断结核感染的价值研究连续收集2014年7月～2015年3月上海市公共卫生临床中心成人确诊结核病人71例,未感染结核对照20例。结合流式细胞术、胞内细胞因子染色,对结核特异性抗原ESAT-6/CFP-10刺激后的特异性效应T细胞进行检测,建立流式胞内细胞因子检测诊断结核感染的方法,所有的受试者同时接受T-SPOT检测。研究结果显示基于流式检测ESAT-6/CFP-10特异性CD4+T细胞能很好地区分结核病人与未感染结核者,并且在诊断方面敏感性(83%)要高于T-SPOT检测(74.6%),由于结核特异性抗原的使用,排除了环境因素及BCG的影响,特异性得到很好的保障,研究也显示特异性达到100%。随后的ROC曲线评价中,AUC的值为0.868,表明流式检测法对于结核感染有着很好的诊断价值。结合上述结果,该方法可作为结核病诊断的有效手段。2.流式细胞术诊断结核感染的优化共刺激与共抑制分子的协同合作在T细胞免疫应答中有着重要的作用,医学上通过共刺激分子或抑制受体活性能达到提高疗效的目的。本研究希望在肯定流式细胞术在检测结核感染实用价值的基础上,加入针对PD-1、SLAM的抗体协同结核特异性抗原共刺激,用流式细胞仪检测各组特异性T淋巴细胞的比例,并与加抗体前进行比较,以期探讨通过该方法上调各细胞因子的分泌水平来提高流式诊断灵敏度的可行性。结果显示,在受试的26名结核病人中,有8名无论是在CD28和CD49d共刺激组,还是aPD-1和aSLAM共刺激组,结核特异性T细胞的比例都表现出明显的增高趋势,并且没有对阴性对照组的背景值造成干扰,对于其他的结核病人检测下来并没有明显的趋势。对此结果,初步认为抑制PD-1信号途径以及SLAM共刺激对提高结核病人的T细胞功能有一定的帮助,但要揭示结核特异性抗原ESAT-6/CFP-10联合aPD-1和aSLAM共刺激能提高流式胞内细胞因子检测技术的灵敏度还需要加大样本量。3.重组结核分枝杆菌ESAT-6/CFP-10变态反应原临床试验前后的评价本研究运用流式胞内细胞因子检测技术对临床上接受ESAT-6/CFP-10变态反应原辅助诊断试验的病人,做一个皮试前后特异性T细胞比值变化的描述。结果显示,受试者注射变态反应原前后结核特异性的IFN-γ+/IL-2+ CD4+T细胞比例均有一个下降的趋势,而TNF-α+CD4+T未呈现出变化。IFN-γ+/INF-α+/IL-2+ CD8+T细胞在接受变态抗原注射后均显示出下降的趋势,但变化统计学分析并不显著。随后对结核特异性IFN-γ、TNF-α、IL-2多功能T细胞进行分析,发现注射变态反应原后病人的IFN-γ+TNF-α+IL-2+CD4+T细胞比例有显著下降趋势,而IFN-γ-TNF-α+IL-2-CD4+T细胞在ESAT-6/CFP-10及PPD刺激后有上升趋势,具有统计学意义。此外IFN-γ+TNF-α+IL-2CD84+T跟IFN-γ+TNF-α-IL-2-CD8+T细胞则有上升的趋势,其中IFN-γ+TNF-α-IL-2-CD8+T细胞尤其显著。这部分数据对临床试验前后受试者的细胞免疫状况做了定量描述,为临床提供辅助参考。