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p53是一种肿瘤抑制基因,它编码的蛋白在细胞周期、细胞凋亡、DNA修复和血管生成的调控中发挥着重要作用。MDM2能够结合p53蛋白并抑制其发挥功能,还能够使p53蛋白发生降解。因此,通过小分子靶向MDM2和p53蛋白的相互作用以重新激活p53蛋白的功能成为很有希望的新型癌症治疗策略。这些小分子被称为MDM2抑制剂,一般通过表面等离子共振(SPR)和荧光偏振(FP)等各种技术进行抑制剂的鉴定,并进行平衡解离常数的测定,但这些技术都具有一定的局限性。本论文开发了一种新的MDM2抑制剂筛选方法—蛋白共表达复合物体系,它能够方便快速的定性鉴定MDM2抑制剂,也能定量测定抑制剂与MDM2的平衡解离常数。铜是几乎所有生物体必需的微量元素,但是细胞内铜的含量是需要严格调控的。人体中的铜转运蛋白(hCTR1)是定位于细胞膜的跨膜转运蛋白,它能够将细胞周质中的铜转运至细胞内,冷冻电镜研究表明hCTR1通过同源三聚体形成的锥形孔来转运铜。hCTR1转运Cu的机制和其N端与膜的作用都是未知的。本论文通过HFIP、SDS胶束和DPPC脂质体模拟细胞质膜,发现在这三种条件下hCTR1(1-46)蛋白的二级结构发生改变。在DPPC磷脂胶束条件下hCTR1(1-46)与Cu(I)反应后构象变化较大,这可能接近出生理状态下hCTR1(1-46)与Cu(I)相互作用的构象变化,同时用DPPC磷脂胶束来研究hCTR1(1-46)与细胞膜的相互作用。第一部分将p53和MDM2蛋白进行文献综述,包括它们的结构与功能,MDM2与p53相互作用的方式以及结构基础,同时介绍了 MDM2的抑制剂研究现状以及抑制剂的新型检测方法。之后介绍了铜的细胞摄取与稳态平衡,hCTR1蛋白的结构与功能,以及hCTR1 N端无规则卷曲序列与Cu的相互作用的研究进展等。第二部分主要介绍了 MDM2/p53-GFP蛋白复合物体系的构建过程,将这个蛋白复合物进行了纯化和表征,并证明该体系具有选择性和特异性。我们分别使用简单的肉眼观察方法、MALDI-TOF、SDS-PAGE电泳以及凝胶过滤层析技术来证明这个蛋白复合物体系的抑制剂筛选功能。通过排除GFP蛋白对MDM2和p53蛋白相互作用的影响,以及MDM2和p53蛋白对GFP蛋白荧光的影响,使用荧光滴定的方法测定了这些已知的小分子和肽抑制剂的平衡解离常数,测得的平衡解离常数和文献中SPR测定的结果基本一致。因此,我们构建的蛋白复合物体系能够简单方便的定性鉴定小分子和肽抑制剂,也可以定量测定小分子和肽抑制剂对MDM2的平衡解离常数。第三部分研究了 hCTR1(1-46)与Cu(Ⅰ)和Cu(Ⅱ)的相互作用。通过紫外滴定方法得到hCTR1(1-46)与Cu(Ⅰ)的结合常数为log K=14.8±0.1,ESI-MS结果表明hCTR1(1-46)能够配位结合6个Cu(Ⅰ)和3个Cu(Ⅱ)。XANES研究表明hCTR1(1-46)与Cu(Ⅰ)结合的配位结构为四面体结构,与Cu(Ⅱ)的配位结构为变形四边形结构。我们选择HFIP溶剂、SDS胶束和DPPC脂质体来模拟细胞膜,通过核磁共振和CD实验技术证明在膜环境下能够使hCTR1(1-46)无规则卷曲结构变少,分别出现α-螺旋和β-折叠以及β-转角结构,同时使hCTR1(146)蛋白的1H-15N HSQC的谱图分散性变好。在缓冲液、SDS和HFIP溶剂条件下,hCTR1(1-46)与Cu(Ⅰ)反应后的构象变化较小;但在DPPC条件下,hCTR1(1-46)与Cu(Ⅰ)反应后的构象变化较大,推测这可能更符合生理条件下hCTR1 N端蛋白与Cu(Ⅰ)反应的真实构象变化。同时用DPPC磷脂胶束来研究hCTR1(146)与细胞膜的相互作用,发现在Cu(Ⅰ)存在的条件下,hCTR1(1-46)蛋白与细胞膜的相互作用变强。