【摘 要】
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目的:1、研究雌激素受体共激活因子3（steroid receptor coactivator-3,SRC-3）在多发性骨髓瘤产生硼替佐米耐药性过程中的作用。2、解析SRC-3在多发性骨髓瘤耐药性中蛋白质修饰和相分离的调控机制。3、验证SRC-3特异性抑制剂SI-2逆转多发性骨髓瘤耐药性的作用和机制方法和结果:1、在以硼替佐米为主治疗方案的多发性骨髓瘤患者中,SRC-3的表达量水平与临床治疗效果呈
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目的:1、研究雌激素受体共激活因子3（steroid receptor coactivator-3,SRC-3）在多发性骨髓瘤产生硼替佐米耐药性过程中的作用。2、解析SRC-3在多发性骨髓瘤耐药性中蛋白质修饰和相分离的调控机制。3、验证SRC-3特异性抑制剂SI-2逆转多发性骨髓瘤耐药性的作用和机制方法和结果:1、在以硼替佐米为主治疗方案的多发性骨髓瘤患者中,SRC-3的表达量水平与临床治疗效果呈负相关。通过显微断层扫描、实时荧光定量PCR、随访分析等实验手段,发现在复发/难治性骨髓瘤患者中,有着较高的SRC-3表达,其预后恢复和骨病变恢复都更差,且SRC-3的表达量与患者的染色体t（4;14）异常呈正相关。2、骨髓瘤细胞中SRC-3的表达量水平与其对硼替佐米的敏感性呈负相关。通过免疫印迹和细胞毒实验检测10种骨髓瘤细胞,发现的SRC-3表达量越高的细胞对硼替佐米的敏感性越低。通过基因编辑技术在骨髓瘤细胞中改变SRC-3的表达水平也能得到同样的结论。利用同位素标记技术鉴定骨髓瘤耐药前后细胞的蛋白质组学变化,分析发现SRC-3在128种升高的蛋白质中。3、SRC-3与NSD2物理上存在相互作用。通过蛋白质谱检技术测骨髓瘤细胞中SRC-3蛋白复合物,发现复合物成分中有NSD2。免疫荧光和邻位连接技术实验发现二者存在共定位。构建SRC-3和NSD2不同的截短体后进行免疫共沉淀,发现SRC-3通过AD2结构域与NSD2的PWWP结构域结合。4、NSD2促进SRC-3蛋白质的稳定性。构建NSD2的突变体,发现NSD2能够通过SET结构域的甲基化酶活功能,促进SRC-3蛋白质的稳定性。5、NSD2促进SRC-3的液-液相分离能力。通过序列分析发现SRC-3具有内在无序区域（为369～1072aa和1085～1424aa区域）。相分离相关实验说明SRC-3具有液-液相分离的特性,其中1085～1424aa刚好包含与NSD2结合的区域AD2（1169～1417aaa）。通过基因编辑技术改变NSD2的表达水平会影响SRC-3的相分离,增加NSD2的表达后SRC-3的相分离能力增强,反之,减弱。6、硼替佐米耐药型骨髓瘤细胞中SRC-3的相分离更明显。通过免疫荧光实验,发现耐药后的细胞中,SRC-3有更明显的蛋白凝集现象,相分离形成数量更多。7、SI-2能干扰NSD2和SRC-3之间的相互作用,并影响SRC-3蛋白质的稳定性和相分离能力。通过免疫共沉淀、蛋白质稳定性和相分离相关实验,发现SI-2能够干扰SRC-3和NSD2之间的相互作用,导致SRC-3蛋白质的稳定性下降,相分离能力减弱。8、SI-2能抑制耐药后相关基因的转录。通过转录组测序及染色质免疫共沉淀测序,SI-2能使转录起始复合物Pol II受到抑制,并导致染色质的H3K36me2的水平下降,抑制耐药相关基因的表达,包括ABC基因家族、BCL2、CCL4等与耐药和抗凋亡相关的基因以及受SRC-3调控的下游基因CBS、TNC、EGR1和IGF1R等。9、SI-2能增加骨髓瘤细胞对硼替佐米的敏感性,逆转骨髓瘤的耐药。通过免疫印迹实验发现,SI-2能明显抑制SRC-3,增加骨髓瘤细胞对硼替佐米的敏感性,促进细胞凋亡。将SI-2与硼替佐米联合处理NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/Sz J（NSG）建立的异种移植瘤和骨髓腔内移植小鼠,通过肿瘤体积检测、免疫组化、免疫荧光和小动物显微断层扫描技术,发现SI-2能够促进硼替佐米抑制肿瘤的生长和增殖,增加肿瘤的细胞凋亡,加速骨破坏的恢复,起到联合治疗的效果,逆转骨髓瘤的耐药。结论:1、多发性骨髓瘤患者的SRC-3的表达量水平与临床治疗效果成负相关,与患者的染色体t（4;14）异常呈正相关。2、细胞水平上SRC-3表达水平与骨髓瘤细胞对硼替佐米的敏感性成负相关。3、分子机制上,SRC-3可以与NSD2直接相互作用,后者促进SRC-3蛋白质的稳定性和相分离,使染色质H3K36me2的水平升高,引起与耐药和抗凋亡相关的基因转录激活,导致耐药。4、SRC-3抑制剂SI-2可以在体内和体外水平上与硼替佐米发挥协同作用,增加骨髓瘤细胞对硼替佐米的敏感性,逆转骨髓瘤的耐药。
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