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鸡白痢沙门菌是严重危害我国家禽养殖业健康发展的常见病原菌之一,雏鸡被感染后发病率和死亡率极高。该菌既可以水平传播,也可以垂直传播,难以在种禽养殖场被清除净化。简单高效低成本地防控鸡群中鸡白痢沙门菌成为当前亟待解决的难题。疫苗接种被认为是降低鸡群感染和防控鸡白痢沙门菌的有效措施之一。沙门菌spiC基因是重要的毒力基因,该基因缺失可显著致弱沙门菌的毒力,并恰当地平衡疫苗候选株的毒力和免疫原性。脂多糖不仅是细菌外膜的组成部分,也是沙门菌毒力的重要因素之一,常被选为DIVA疫苗的靶标分子。沙门菌减毒疫苗候选株主要运用现代基因工程的同源重组方法敲除一个或多个基因所得,具有遗传背景清晰,操作容易,制备快捷等优点;但常用的同源重组方法,由于筛选的需要,基因缺失株往往残留抗生素基因或部分外源片段,给缺失基因的恢复或其它外源基因的插入提供可能性,遗传稳定性存在安全隐患。因此,为了满足转基因微生物安全评估的要求,通过无痕基因敲除技术构建基因缺失疫苗候选株,不残留有任何外源基因或碱基,就显得十分必要。本研究利用无痕敲除的同源重组方法,同时缺失spiC和rfaL或rfaH基因,构建鸡白痢沙门菌S06004△spiC△rfaH和S06004△spiC△rfaL双基因缺失株,并进行实验室的安全性与免疫保护效力评估。1.鸡白痢沙门菌疫苗候选株的无痕构建与生物学特性研究本研究通过改良的自杀质粒pGMB152介导的同源重组的方法无痕构建了鸡白痢沙门菌S06004△spiCΔrfaH和S06004ΔspiC△rfaL双基因缺失株,并评价了其生物学特性,以及安全性与免疫保护效力。PCR和测序结果表明,无痕双基因缺失株成功构建。生物学特性分析显示,这两株双基因缺失株生化特性没有发生改变,生长速度相比于野生株也没有明显变化;半数致死量结果显示两株双基因缺失株的毒力均下降了 100倍左右。以禽巨噬细胞HD-11为感染模型结果显示双基因缺失株对HD-11细胞的黏附、侵袭以及在细胞内的增殖能力相比于野生株无明显差异。2.鸡白痢沙门菌疫苗候选株安全性与免疫保护效力评价对双基因缺失株S06004△spiCΔrfaH和S06004ΔspiC△rfaL进行减毒疫苗候选株的安全性与免疫保护效力评价,通过肌肉注射的方式对3日龄海兰白雏鸡进行免疫,免疫后雏鸡的存活情况以及临床反应均表现良好,且体重相比于对照组也没有发生明显变化。病理结果显示,疫苗组相比于空白对照组没有发现明显病变。细菌在体内动态消长分析显示,2株双基因缺失疫苗株21天在肝脏和脾脏就被完全清除,而野生组细菌在28天仍能在肝脏和脾脏中被检测到,结果说明2株双基因缺失疫苗株相比于野生株能够更快被机体清除。间接ELISA检测血清中IgG抗体,结果显示免疫2周后能检测到高水平的沙门菌抗体。荧光定量PCR检测免疫后雏鸡脾脏中细胞因子的表达,结果显示IL-2、IFN-γ和 IL-1β在免疫初期大量表达,而IL-4在免疫后14天表达量明显上调。免疫2周后,使用用野生株鸡白痢沙门菌S06004进行攻毒,发现雏鸡存活率可以达到90%左右,而对照组只有27%。以上结果表明,疫苗候选株具有良好的安全性与免疫保护效力。同样口服免疫结果显示,免疫2周后,用野生株进行攻毒,发现雏鸡存活率可以达到100%左右,而对照组只有20%。血清玻板凝集试验表明,2株疫苗候选株免疫后的血清不能与商品化抗原凝集,具有鉴别野生菌感染和疫苗免疫的DIVA能力。无痕基因敲除构建的S06004△spiCΔrfaH和S06004△spiCΔrfaL缺失株安全性和免疫保护效力良好,并具有DIVA能力,为我国家禽养殖业中鸡白痢沙门菌防控提供帮助。