骨肉瘤是常见的青少年骨原发恶性肿瘤之一,恶性程度高,易复发和转移。骨肉瘤的转移多发生于早期,80%~90%的患者就诊时已存在临床上不能发现的转移灶。近年来骨肉瘤的长期生存率并没有明显提高,骨肉瘤的治疗效果仍处于“瓶颈期”,骨肉瘤细胞对化疗的敏感性差以及极强的复发性是临床和基础研究亟待解决的问题。而随着骨肉瘤干细胞(osteosarcoma stem cell,OSC)的发现和证明,靶向OSC被认为提供了治疗骨肉瘤的新方向。骨肉瘤是血管极为丰富的肿瘤,在青少年高发,且治疗效果并不十分令人满意,手术和放化疗结果并不能很好的控制病情发展,预后很差。因此,通过肿瘤干细胞方向对骨肉瘤进行深入研究对于改善预后很有必要。CSC自我更新调控机制的研究是“删除”CSC的切入点。印迹基因TSSC3(tumor-suppressing STF c DNA 3)又名PHLDA2,已被我们课题组证明了其抑癌基因的作用,进一步的研究发现其与OSC自我更新可能相关;过表达TSSC3可以抑制OSCs的干性转录因子OCT4、SOX2及Nanog的表达,其中以Nanog转录因子表达下降最明显,但Nanog在骨肉瘤中的作用及其调控机制尚不明确。Nanog作为干性相关核转录因子,其在多种CSC中都发现和自我更新能力密切相关;Notch通路是重要的生长、分化调控相关的信号通路,在多种CSC中已被证明其激活和自我更新相关,并且有文献报道在骨肉瘤和胶质瘤细胞中都存在Notch通路关键分子的上调,但在OSC中的作用及分子机制尚不清楚。已有研究发现,胰腺癌中Notch1的合成和活化可能受到Src活性的影响,而TSSC3已被证明可以强烈抑制Src活性,因此TSSC3可能通过Src分子与Notch通路产生联系,共同影响OSC的干性特征。肿瘤干细胞血管微环境(Perivascular niche)可能包括定位于血管内皮细胞旁的CSC、血管内皮细胞、信号通路相关分子、免疫细胞、成纤维细胞等。骨肉瘤是极富血管的恶性肿瘤,是研究肿瘤干细胞血管微环境的很好的模型。血管微环境已被发现在GSC(胶质瘤干细胞)自我更新调控中起到重要作用,其中内皮细胞是GSC血管微环境的重要组成部分。以往研究证明内皮细胞可以增强GSC自我更新能力,为了发展靶向OSC的新治疗方法,内皮细胞影响OSC的自我更新的分子机制也非常值得研究。因此,本文重点探索了TSSC3基因、Notch通路及血管内皮细胞对OSC自我更新能力的影响和机制。本文采用体外基因过表达和敲低技术、PCR、Western-blot、皮下移植瘤和颅内移植瘤模型、临床病理资料分析、免疫组化、免疫荧光、流式细胞术、Transwell双室共培养等实验技术方法,分别在第一部分研究了印迹基因TSSC3、Nanog在维持OSC干性表型中的作用,并在第二部分初步筛选了Notch通路众多相关分子中有可能影响OSC的配体和受体,以及在内皮细胞微环境中的作用。主要的实验内容及实验结果和结论如下:一、TSSC3可通过Src/Akt抑制Nanog表达并抑制OSC干性表型1.TSSC3可以抑制OSC干性表型通过免疫组化方法、RT-PCR、Western-blot方法、成球培养方法、流式细胞术等实验方法得到以下结果:1.1高表达TSSC3的患者预后在总生存期(OS)和无病生存期(PFS)都远好于低表达TSSC3的患者(P<0.05);TSSC3基因具有提示肿瘤复发潜能的作用,在复发VS未复发的病人中阳性比例是1/15 VS 9/26,P<0.05。1.2利用成球培养的方法富集不同骨肉瘤细胞株(MTH、Sao S2)的OSC,干性相关核蛋白(Nanog、Sox2、Oct4)表达的升高;且在OSC中TSSC3表达明显降低。1.3通过在不同骨肉瘤细胞系中建立TSSC3过表达模型,检测到过表达TSSC3后Nanog的表达显著降低,同时骨肉瘤细胞系的体外成球能力和成球体积都有明显下降(MTH细胞在5个/孔浓度下平均每个细胞能产生0.44±0.09个细胞球VS 0.23±0.02个,P<0.05;Sa OS2细胞在5个/孔浓度下平均每个细胞能产生0.42±0.18个细胞球VS0.34±0.07个,P<0.05),干性表面标记CD133、CD117、Stro1表达也明显下降(P<0.05)。2.过表达Nanog可以增强OSC干性表型通过免疫组化方法、成球培养方法、流式细胞术、裸鼠成瘤能力实验、划痕实验和Transwell侵袭实验、化疗抵抗实验等方法得到以下结果:2.1高表达Nanog和发生转移的骨肉瘤患者有强相关性,在发生转移VS未发生转移的患者中Nanog的阳性表达比例为7/12 VS 9/29,P<0.05;高表达Nanog的患者的总生存期和无病生存期均明显延长(P<0.05)。2.2在过表达TSSC3的细胞模型上再次过表达了Nanog,检测到过表达Nanog后其体外成球能力和成球体积都有显著增强。(MTH细胞在5个/孔浓度下平均每个细胞能产生0.45±0.05个细胞球VS 0.83±0.12个,P<0.05;Sa OS2细胞在5个/孔浓度下平均每个细胞能产生0.35±0.13个细胞球VS 0.78±0.23个,P<0.05)。过表达TSSC3的骨肉瘤细胞系的裸鼠成瘤能力明显降低,再次过表达Nanog后其成瘤能力再次增强,MTH细胞成瘤数在每个注射点10000个细胞时为3/5 VS 2/5 VS 5/5,每个注射点1000个细胞时为2/5 VS 1/5 VS 5/5;Sa OS2细胞成瘤数在每个注射点40000个细胞时为4/5 VS 4/5 VS5/5,每个注射点4000个细胞时为3/5 VS 1/5 VS 4/5。2.3过表达Nanog的骨肉瘤细胞系的侵袭、迁移能力明显增强(P<0.05),并且在顺铂的化疗抵抗实验中其化疗抵抗能力增强,通过剂量依赖曲线发现过表达Nanog后顺铂的IC50值也有很明显升高。3.敲低Nanog的骨肉瘤细胞系的干性表型明显下降。通过成球培养方法、裸鼠成瘤能力实验、划痕实验和Transwell侵袭实验、化疗抵抗实验等方法得到以下结果:3.1极限稀释法发现敲低Nanog后的骨肉瘤细胞系其体外成球能力和成球体积都有显著降低(MTH细胞敲低Nanog后在5个/孔浓度下平均每个细胞能产生细胞球数为0.83±0.28 VS 0.28±0.22和0.68±0.21个,P<0.05;Sa OS2细胞敲低Nanog后在5个/孔浓度下平均每个细胞能产生细胞球数为0.78±0.24 VS 0.52±0.23,0.37±0.25个,P<0.05)。敲低Nanog后的MTH细胞成瘤数在每个注射点40000个细胞时为5/5 VS 3/5,每个注射点4000个细胞时为4/5 VS 2/5;Sa OS2细胞成瘤数在每个注射点40000个细胞时为5/5 VS 4/5,每个注射点4000个细胞时为4/5 VS 2/5。3.2划痕实验和Transwell侵袭实验发现敲低Nanog的骨肉瘤细胞系的侵袭、迁移能力明显减弱(P<0.05)。在顺铂的化疗抵抗实验中其化疗抵抗能力也有减弱,通过剂量依赖曲线发现敲低Nanog后顺铂的IC50值也有很明显下降。4.Src介导了TSSC3敲低Nanog的作用通过成球培养方法、PT-PCR、Western-blot、药物抑制实验、si RNA转染实验、流式细胞术等方法得到以下结果:4.1在过表达TSSC3的细胞系中检测了p-Src和p-Akt的表达,发现伴随着TSSC3的上调,p-Src和p-Akt的表达发生了下调。利用Src抑制剂PP2抑制Src通路活性,检测到Nanog的表达下降(P<0.05)。4.2利用Src si RNA和Lv-TSSC3进行同时处理,检测Nanog的基因表达情况,发现敲低Src后可以抑制Nanog表达(P<0.05),在此基础上过表达TSSC3无法进一步抑制Nanog表达(P>0.05)。敲低Src后可以抑制骨肉瘤细胞的体外成球数量和成球体积以及干性表面标记的表达(P<0.05),在此基础上过表达TSSC3后无法进一步抑制体外成球能力和干性表面标记的表达。5.Akt通路介导了TSSC3敲低Nanog的作用通过成球培养方法、PT-PCR、Western-blot、药物抑制与刺激实验、流式细胞术等方法得到以下结果:5.1 p-Src和p-Akt的表达在干细胞中的表达相对于对应的单层贴壁细胞中都明显增强(P<0.05)。利用Akt抑制剂LY294002对细胞进行持续培养后,发现抑制Akt磷酸化活性可以抑制Nanog表达(P<0.05)。5.2利用Akt通路激活剂IGF1和Lv-TSSC3进行同时处理,发现Akt激活后可以明显增强Nanog表达,而过表达TSSC3后再激活Akt通路可以回复Nanog的表达。在IGF1和Lv-TSSC3同时分组处理时,Akt激活后可以明显增强体外成球数量和成球体积以及干性表面标记的表达,而过表达TSSC3后再激活Akt通路可以回复体外成球能力和干性表面标记表达。6.各分子表达与骨肉瘤病人临床病理参数和预后的关系通过免疫组化方法和统计学分析,实验得到了以下结果:p-Src高表达与骨肉瘤病人总生存期和无病生存期较短有极强的联系(P<0.05),而p-Akt表达与骨肉瘤病人预后没有明显联系,P>0.05。在临床标本上p-Src表达与p-Akt表达有明显正相关(P<0.05),p-Src表达与Nanog表达有明显正相关(P<0.05)。p-Src表达量与病人转移率正相关(发生转移VS未发生转移的患者的p-Src阳性比例为7/12 VS 8/29,P<0.05),也与截肢手术采用率正相关(采用截肢手术VS采用局部切除手术的患者p-Src阳性比例为11/20 VS 4/21,P<0.05),而Akt通路与以上参数没有明显联系。二、Notch通路和内皮细胞在维持OSC干性中发挥作用。1.通过成球培养法建立了U2OS的细胞球模型通过RT-PCR和Western-blot实验检测到U2OS细胞球中的干性转录因子Oct4、Nanog的表达相比相应的贴壁细胞都有明显增高(P<0.05),而Sox2在U2OS中表达量较低,没有明确趋势。2.Hes1是Notch通路在OSC中起作用的效应分子通过RT-PCR和Western-blot实验,发现Notch通路的两个重要下游效应分子Hes1、Hey1的表达,在三种细胞系的细胞球中都有明显上调(P<0.05);但是Hey1在蛋白水平并不能很明确的检测到。3.DLL4是Notch通路在OSC中起作用的配体之一RT-PCR和Western-blot实验检测了Notch通路的众多配体在干细胞和贴壁细胞中的表达差异,发现其中DLL4的表达上调最为明显(P<0.05),并且在三种干细胞球中都表现一致。4.Notch3是Notch通路在OSC中起作用的受体之一RT-PCR、Western-blot和免疫荧光实验分析了四种Notch受体的表达和激活情况,发现Notch1、Notch3、Notch4的表达在不同的细胞球存在不同程度的表达上调,Notch3的上调程度在三种干细胞球中最大,最一致(P<0.05),而Notch3的效应剪切体在干细胞中的表达量也是明显高于贴壁细胞的。只有Notch3在三种OSC中都出现了明显的核转位和表达上调的现象。5.内皮细胞在维持OSC干性中可能通过Notch通路起作用利用直接细胞共培养模型检测了和骨肉瘤细胞共培养的内皮细胞HUVEC内Notch配体表达,发现DLL1、DLL4明显上调(P<0.05);和内皮细胞共培养的骨肉瘤细胞内hey1和Nanog表达显著上调(P<0.05)。