论文部分内容阅读
头颈部肿瘤大约占机体全部肿瘤的5%左右,而80-90%的头颈部肿瘤是由鳞状细胞癌构成的。虽然肿瘤的诊治得到了迅速的发展,但头颈部鳞状细胞癌的5年总体生存率在大多数肿瘤中仍然是较低的一类肿瘤。肿瘤抑制因子P12CDK2AP1负向调节CDK2的活性并能够抑制DNA的复制,而它在头颈部鳞状细胞癌中表达却是被明显下调甚至缺失的。目前P12CDK2AP1在头颈部鳞状细胞癌中所发挥的作用尚不明确。因此阐明P12CDK2AP1在头颈部鳞癌发生、发展过程中的作用显得尤为重要。本项研究证实在头颈部鳞癌中miR-21在P12CDK2AP1调控过程中发挥着重要的作用,或许可以成为一个有效的治疗靶点。目的:1.研究P12CDK2AP1在细胞生物学行为（侵袭和增殖）中所发挥的作用。2.探索P12CDK2AP1是否受到miRNAs的调控,以及这种调控所产生的生物学效应。方法:1.包含CMV和U6启动子,可以通过限制性内切酶位点连接编码shRNAs寡核苷酸的第三代自失活病毒载体购自上海吉凯基因有限公司。我们构建了四对针对于人CDK2AP1- mRNA的慢病毒干扰序列载体,分别命名为KD-1, KD-2,KD-3和KD-4.以HEK293T细胞为工具细胞进行病毒的包装,最终选取KD-3进行各个实验组的慢病毒感染和后续的实验。2.CDK2AP1-mRNA和蛋白水平的检测通过Quantitative Real Time PCR和Western blot分析进行。3.根据CDK2AP1 GenBank序列号No. NM004642,我们利用生物信息学软件预测了与该基因相互作用的miRNAs靶点。最终我们选定了miR-21进行后续的实验研究。4.我们在CDK2AP1基因3’-UTR区克隆了一个包含miR-21潜在作用位点的报告质粒。从而通过报告基因系统对预测的结合位点进行进一步的验证。5.分别将pre-miR-21或者anti-miR-21进行相应组别的转染,然后进行生物学效应的检测:细胞增殖活性的检测如MTT和流式细胞术分析;以及细胞侵袭的相关分析如软琼脂培养和Transwell侵袭测定。结果:1.在HaCaT细胞（人源性角化上皮细胞）的lenti-shCDK2AP1感染组,CDK2AP1- mRNA和P12CDK2AP1的表达水平被明显调低。2. P12CDK2AP1表达被调低以后可以明显促进培养细胞的增殖和细胞周期的转化。3.通过生物学信息软件我们预测到CDK2AP1基因3’-UTR区存在着miR-21的作用位点。并通过报告基因系统进行了进一步验证。4.通过实验证实在HaCaT和Tca8113细胞中P12CDK2AP1和miR-21的表达呈负相关。5.实验数据显示,miR-21能够下调P12CDK2AP1的表达,并能够促进细胞的侵袭和增殖能力。结论:1.在本项研究中,我们构建了可以携带特定基因干扰序列的慢病毒载体,并证实在感染细胞的过程中它可以有效下调目的基因的表达,同时也证实了下调P12CDK2AP1的表达可以促进细胞的增殖。2.研究显示miR-21在转录后水平通过特定的靶序列下调肿瘤抑制因子P12CDK2AP1的表达,同时也证实了miR-21可以促进培养细胞的侵袭和增殖能力。