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脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,具有高发病率、高度侵袭性、高死亡率的特点。该肿瘤通过对整个大脑的广泛入侵表现出了持续的恶性进展特点,并对传统的放疗具有抵抗力,故临床上治疗十分棘手。近年研究表明,术后肿瘤细胞对放疗不敏感与NF-κB信号通路活性增高有关。肿瘤的放射治疗一般是通过损伤DNA,诱导细胞凋亡,阻断细胞增殖从而消除肿瘤细胞。DNA损伤激活的NF-κB信号通路诱导细胞凋亡是放疗的主要作用机制之一。但是NF-κB通路在DNA损伤诱导的凋亡反应中是一把双刃剑,具有双重作用,其促进细胞凋亡的同时,还将诱导抗凋亡基因的表达。一旦NF-KB活性异常增高或者持续活化,则表现出抗凋亡作用,通过诱导抗凋亡及促进细胞增殖相关靶基因的表达,包括Bcl-2家族,Survivin,COX-2,Cyclin D1,AKT及EGFR等,导致肿瘤细胞周期进程加快,抗凋亡能力增强,侵袭及转移能力增强,从而对放疗产生抗性。由于NF-κB介导的下游靶基因有很大一部分是细胞正常生命进程所需要的,因此广谱阻断NF-κB意味着很多不良反应的产生。理想的NF-κB抑制剂应是能特异性作用于肿瘤细胞,而非正常细胞,从而达到精确清除肿瘤细胞的目的。不同组织来源的肿瘤细胞对DNA损伤的耐受性及反应性不同,对放疗的敏感性也不同。DNA损伤诱导的NF-KB信号通路起抗凋亡作用还是促凋亡作用具有一定的组织特异性。因此深入探讨特定条件诱导NF-KB通路的分子机理、调控机制及其组织特异性,有利于我们针对NF-κB在肿瘤放疗耐受中的作用,提出特异而有效的个体化治疗方案。本研究着眼于胶质瘤对放疗不敏感这一临床问题,拟在胶质瘤细胞系T98G及U87MG中探讨NF-KB通路与基于DNA损伤诱导的胶质瘤放疗不敏感的作用机制,以期为有效的胶质瘤放疗提供理论依据。实验用细胞辐照仪处理人胶质瘤细胞系T98G及U87MG,以模拟DNA损伤环境。研究发现胶质瘤细胞系T98G及U87MG对DNA损伤诱导的细胞凋亡及增殖抑制不敏感,但抑制NF-κB活性则增强其对DNA损伤的敏感性。分子机制研究发现,DNA损伤能显著增强胶质瘤细胞中NF-κB的活性,导致NF-KB介导的靶基因,包括Bcl-κL, Cyclin Dl, Survivin,及IL-8等高表达,从而增强肿瘤细胞抗凋亡活性,促进肿瘤生长。利用分子生物学研究手段,发现DNA损伤可增强NEMO的SUMO化修饰。NEMO的SUMO化修饰是细胞核内的DNA损伤信号激活细胞核外的NF-κB信号通路传导的限速步骤,因此增强NEMO的SUMO化修饰对于DNA损伤诱导的NF-KB活化至关重要。进一步研究发现,NF-κB活化可促进miR-181b表达升高,而miR-181b可靶向去SUMO化酶SENP2,使其表达下降,降低了SENP2催化的NEMO去SUMO化修饰,从而促使NF-KB保持持续活化状态。而miR-181b有望成为提高胶质瘤放射治疗效果的新靶点。第一部分：DNA损伤激活人脑胶质瘤细胞NF-κB信号通路目的：探讨人胶质瘤细胞T98G,U87MG对DNA损伤诱导的细胞凋亡及增殖抑制是否敏感,及其与NF-κB信号通路的关系。方法：应用电离辐射处理T98G及U87MG细胞诱导DNA损伤。免疫荧光检测DNA损伤标志物H2AX-γ来判断DNA损伤效果。划痕实验检测细胞划痕愈合能力；流式细胞仪检测细胞凋亡；MTT检测细胞增殖；Real-time PCR检测NF-KB调控的与肿瘤生长及转移相关的靶基因的表达水平；双荧光素酶报告系统检测NF-κB的活性；Western blot检测p-IκBα、IKBα、p50及p65水平；免疫荧光检测DNA损伤处理后T98G细胞中p65是否入核。结果：电离辐射处理T98G细胞,能造成DNA损伤；DNA损伤不影响胶质瘤细胞T98G的划痕愈合能力,不诱导其凋亡；用Bay11抑制NF-κB活性后,T98G细胞的划痕愈合能力下降,细胞增殖受抑制；抑制NF-κB活性能下调T98G细胞中DNA损伤诱导的肿瘤抗性基因,包括CyclinD1、Bcl-xL、Survivin及IL-8的表达；DNA损伤能激活胶质瘤细胞T98G及U87MG细胞中NF-κB信号通路传导,促进IκBα磷酸化及降解,从而释放NF-KB使其入核。结论：1、人胶质瘤细胞系T98G及U87MG对DNA损伤不敏感。抑制NF-κB活性后,敏感性增强。2、DNA损伤激活人胶质瘤细胞系T98G及U87MG中NF-KB信号通路。第二部分：miR-181b通过靶向SENP2正调控DNA损伤诱导的NF-κB通路活性目的：探讨DNA损伤增强人胶质瘤细胞T98G及U87MG中NF-KB通路活性的分子机制。方法：应用免疫沉淀技术检测DNA损伤后NEMO的SUMO化修饰；利用软件预测NEMO的去SUMO化酶SENP2上microRNA的作用靶点；双荧光素酶报告系统及Western blot检测SENP23’UTR是否含有miR-181b的作用靶点；MicroRNA特异的real-time PCR检测DNA损伤处理前后U87MG细胞中microRNA表达量的变化；双荧光素酶报告系统检测miR-181b对NF-κB通路活性的调控。结果：DNA损伤能促进U87MG细胞中NEMO的SUMO化修饰；软件预测显示去SUMO化酶SENP2的3’UTR含有miR-181b作用位点；双荧光素酶报告系统及Western blot证实miR-181b可以靶向SENP2,使其表达降低：DNA损伤后miR-181b表达升高；过表达的miR-181b会进一步增强DNA损伤诱导的NF-κB通路活性。结论：1、DNA损伤能促进胶质瘤细胞中NEMO的SUMO化修饰。2、DNA损伤后,miR-181b表达升高,miR-181b可靶向于去SUMO化酶SENP2,使其表达降低,而不能抑制NEMO的SUMO化修饰,从而进一步增强NF-κB舌性。